Το αντίστροφο μεταγραφόμενο RNA SARS-CoV-2 μπορεί να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα καλλιεργημένων ανθρώπινων κυττάρων (άρα και σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα) και μπορεί να εκφραστεί σε ιστούς που προέρχονται από ασθενείς

Liguo Zhanga, Alexia Richards, M. Immaculate Barrasaa, Stephen H. Hughes, Richard A. Younga και Rudolf Jaenischa,1
ένα Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA 02142; σι

Πρόγραμμα Δυναμικής και Αναδιπλασιασμού του HIV, Κέντρο Έρευνας για τον Καρκίνο, Εθνικό Καρκίνο

Institute, Frederick, MD 21702; και γ

Τμήμα Βιολογίας, Ινστιτούτο Τεχνολογίας της Μασαχουσέτης, Cambridge, MA 02142
Συνεισφορά από τον Rudolf Jaenisch, 19 Απριλίου 2021 (εστάλη για αναθεώρηση στις 29 Μαρτίου 2021, κριτική από Anton Berns και Anna Marie Skalka)

Παρατεταμένη ανίχνευση σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου κορο-
RNA του ναυτικού 2 (SARS-CoV-2) και επανεμφάνιση θετικών δοκιμασιών PCR

έχουν αναφερθεί ευρέως σε ασθενείς μετά την ανάρρωση από τον COVID-
19, αλλά ορισμένοι από αυτούς τους ασθενείς δεν φαίνεται να αποβάλλουν μολυσματικές

ιός. Ερευνήσαμε την πιθανότητα να είναι τα RNA του SARS-CoV-2
αντίστροφη μεταγραφή και ενσωμάτωση στο DNA των ανθρώπινων κυττάρων
καλλιέργεια και ότι η μεταγραφή των ολοκληρωμένων αλληλουχιών θα μπορούσε

ευθύνονται για ορισμένες από τις θετικές δοκιμασίες PCR που παρατηρήθηκαν σε ασθενείς. σε υπερ-
λιμάνι αυτής της υπόθεσης, βρήκαμε ότι αντίγραφα DNA του SARS-CoV-2

Οι αλληλουχίες μπορούν να ενσωματωθούν στο γονιδίωμα του μολυσμένου ανθρώπου
κύτταρα. Βρήκαμε διπλασιασμούς τοποθεσιών-στόχων που πλαισιώνουν τις ιογενείς αλληλουχίες
και συναινετικές αλληλουχίες αναγνώρισης ενδονουκλεάσης LINE1 στο

τοποθεσίες ολοκλήρωσης, σύμφωνα με ένα ρετρομεταθετόνιο LINE1-
αντίστροφη μεταγραφή και αναδρομή με μεσολάβηση, με εκκίνηση στόχου

μηχανισμός. Βρήκαμε επίσης, σε ορισμένους ιστούς που προέρχονται από ασθενείς,
dence υποδηλώνοντας ότι ένα μεγάλο κλάσμα των ιικών αλληλουχιών είναι

μεταγραφή από ολοκληρωμένα αντίγραφα DNA αλληλουχιών ιών, γεν.
λήψη χιμαιρικών μεταγραφών ιού-ξενιστή. Η ενσωμάτωση και η μεταγραφή-
ιϊκές αλληλουχίες μπορεί έτσι να συμβάλει στην ανίχνευση του ιού

RNA με PCR σε ασθενείς μετά από μόλυνση και κλινική ανάρρωση. Επειδή
έχουμε ανιχνεύσει μόνο υπογονιδιωματικές αλληλουχίες που προέρχονται κυρίως από
το 3′ άκρο του ιικού γονιδιώματος ενσωματωμένο στο DNA του ξενιστή
κύτταρο, μολυσματικός ιός δεν μπορεί να παραχθεί από το ενσωματωμένο
υπογονιδιωματικές αλληλουχίες SARS-CoV-2.
SARS-CoV-2 | αντίστροφη μεταγραφή | ΓΡΑΜΜΗ 1 | γονιδιωματική ενσωμάτωση | χιμαιρικός
RNA
Συνεχής ή υποτροπιάζουσα θετική σοβαρή οξεία αναπνευστική
Συνδρόμου κορωνοϊού 2 (SARS-CoV-2) έχουν πραγματοποιηθεί δοκιμές PCR
αναφέρεται σε δείγματα που ελήφθησαν από ασθενείς εβδομάδες ή μήνες μετά
ανάρρωση από μια αρχική μόλυνση (1–17). Αν και καλόπιστος
επαναμόλυνση με SARS-CoV-2 μετά την ανάρρωση έχει πρόσφατα
αναφέρθηκαν (18), μελέτες βασισμένες σε κοόρτη με υποκείμενα που κρατήθηκαν αυστηρά
Η καραντίνα μετά την ανάρρωσή τους από τον COVID-19 το πρότεινε
τουλάχιστον ορισμένες «επαναθετικές» περιπτώσεις δεν προκλήθηκαν από επαναμόλυνση

(19, 20). Επιπλέον, κανένας ιός ικανός για αναπαραγωγή δεν ήταν ισο-
καθυστερημένη ή εξαπλωμένη από αυτούς τους θετικούς στην PCR ασθενείς (1–3, 5, 6, 12,

16), και η αιτία για την παρατεταμένη και επαναλαμβανόμενη παραγωγή του
Το ιικό RNA παραμένει άγνωστο. Ο SARS-CoV-2 είναι θετικός κλώνος

ιός RNA. Όπως και άλλοι βήτα κορωνοϊοί (SARS-CoV-1 και Mid-
dle κορονοϊός που σχετίζεται με το αναπνευστικό σύνδρομο Ανατολής), SARS-CoV-2

χρησιμοποιεί μια RNA-εξαρτώμενη RNA πολυμεράση για την αντιγραφή της
γονιδιωματικό RNA και μεταγραφή υπογονιδιωματικών RNA (21–24). Ενας
πιθανή εξήγηση για τη συνεχιζόμενη ανίχνευση του SARS-CoV-2
ιικό RNA απουσία αναπαραγωγής ιού είναι αυτό, σε ορισμένους
περιπτώσεις, αντίγραφα DNA των ιικών υπογονιδιωματικών RNA μπορεί να ενσωματωθούν
στο DNA του κυττάρου ξενιστή με αντίστροφη μεταγραφή
μηχανισμός. Η μεταγραφή των ενσωματωμένων αντιγράφων DNA θα μπορούσε

είναι υπεύθυνος για θετικές δοκιμές PCR πολύ μετά την αρχική εισαγωγή
εκκαθαρίστηκε. Πράγματι, αλληλουχίες ιού RNA μη ρετροϊού

έχουν ανιχνευθεί στα γονιδιώματα πολλών ειδών σπονδυλωτών
(25, 26), με αρκετές ενσωματώσεις να παρουσιάζουν συνεπή σήματα

με την ενσωμάτωση αντιγράφων DNA ιικών mRNAs στο
βλαστική σειρά μέσω αρχαίου μακράς διάσπαρτου πυρηνικού στοιχείου (LINE)
ρετροτρανσποζόνια (ανασκόπηση στην αναφορά 27). Επιπλέον, μη ρετροϊική
Ιοί RNA όπως ιός φυσαλιδώδους στοματίτιδας ή λεμφοκυτταρικός
Ο ιός της χοριομηνιγγίτιδας (LCMV) μπορεί να μεταγραφεί αντίστροφα σε
Το DNA αντιγράφεται από μια ενδογενή ανάστροφη μεταγραφάση (RT) και
Έχει δειχθεί ότι τα αντίγραφα DNA των ιικών αλληλουχιών ενσωματώνονται
στο DNA των κυττάρων-ξενιστών (28-30). Επιπλέον, τα κυτταρικά RNA, για
για παράδειγμα, τα ανθρώπινα μεταγραφήματα APP έχουν αποδειχθεί ότι είναι

αντίστροφη μεταγραφή από ενδογενή RT σε νευρώνες με την εκ νέου
sultant θραύσματα ΑΡΡ ενσωματώθηκαν στο γονιδίωμα και εκφράστηκαν

(31). Στοιχεία ανθρώπινης LINE1 (~ 17% του ανθρώπινου γονιδιώματος), α

τύπος αυτόνομων ρετροτρανσποζονίων, τα οποία είναι σε θέση να
μεταφέρουν τους εαυτούς τους και άλλα μη αυτόνομα στοιχεία όπως

ως Alu, αποτελούν πηγή κυτταρικής ενδογενούς RT (32-34). Endog-
enous στοιχεία LINE1 έχουν αποδειχθεί ότι εκφράζονται σε παλαιό

ανθρώπινοι ιστοί (35) και σωματικά ρετρό με τη μεσολάβηση LINE1
Η μεταφορά είναι συχνή σε ασθενείς με καρκίνο (36, 37). Εξάλλου,

έκφραση της ενδογενούς LINE1 και άλλων ρετροτρανσποζονίων
στα κύτταρα-ξενιστές συνήθως ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά την ιογενή μόλυνση,
συμπεριλαμβανομένης της λοίμωξης SARS-CoV-2 (38–40).
Σημασία
Ένα ανεπίλυτο ζήτημα της νόσου SARS-CoV-2 είναι ότι οι ασθενείς
συχνά παραμένουν θετικά για ιικό RNA όπως ανιχνεύεται με PCR πολλά
εβδομάδες μετά την αρχική μόλυνση ελλείψει στοιχείων για
ιική αναπαραγωγή. Δείχνουμε εδώ ότι το RNA του SARS-CoV-2 μπορεί να είναι

αντίστροφη μεταγραφή και ενσωμάτωση στο γονιδίωμα του
μολυσμένο κύτταρο και να εκφραστεί ως χιμαιρικά μεταγραφήματα που συντήκονται ιικά

με κυτταρικές αλληλουχίες. Είναι σημαντικό, τέτοιες χιμαιρικές μεταγραφές
ανιχνεύονται σε ιστούς που προέρχονται από τον ασθενή. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι,
σε ορισμένους ιστούς ασθενών, η πλειονότητα όλων των ιικών μεταγραφών είναι

που προέρχονται από ολοκληρωμένες ακολουθίες. Τα δεδομένα μας παρέχουν μια
όραση στις συνέπειες των λοιμώξεων SARS-CoV-2 που μπορεί

βοηθά να εξηγηθεί γιατί οι ασθενείς μπορούν να συνεχίσουν να παράγουν ιικό RNA
μετά την ανάρρωση.
Συνεισφορές συγγραφέων: LZ, RAY και RJ σχεδιασμένη έρευνα. Οι LZ και AR πραγματοποίησαν
πειράματα? Τα δεδομένα που ανέλυσαν τα LZ, AR, MIB, SHH, RAY και RJ. και LZ και RJ
έγραψε την εργασία με τη συμβολή όλων των συγγραφέων.
Κριτικές: AB, Netherlands Cancer Institute; και AMS, Fox Chase Cancer Center.
Δήλωση ανταγωνιστικού ενδιαφέροντος: Η RJ είναι σύμβουλος/συνιδρυτής της Fate Therapeutics, Fulcrum
Therapeutics, Omega Therapeutics και Dewpoint Therapeutics. Η RAY είναι ιδρυτής και
μέτοχος των Syros Pharmaceuticals, Camp4 Therapeutics, Omega Therapeutics και
Dewpoint Therapeutics.
Αυτό το άρθρο ανοιχτής πρόσβασης διανέμεται υπό την άδεια Creative Commons Attribution License 4.0
(CC BY).
1
Σε ποιους μπορεί να απευθύνεται η αλληλογραφία. Email: jaenisch@wi.mit.edu.
Αυτό το άρθρο περιέχει υποστηρικτικές πληροφορίες στο διαδίκτυο στη διεύθυνση https://www.pnas.org/lookup/suppl/
doi:10.1073/pnas.2105968118/-/DCSupplemental.
Δημοσιεύθηκε στις 6 Μαΐου 2021.

PNAS 2021 Vol. 118 Αρ. 21 e2105968118 https://doi.org/10.1073/pnas.2105968118 | 1 από 10

Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι οι αλληλουχίες SARS-CoV-2 μπορούν να
τρίψτε στο γονιδίωμα του κυττάρου ξενιστή με ένα ρετρό με τη μεσολάβηση LINE1
μηχανισμός θέσης. Παρέχουμε αποδείξεις ότι το ολοκληρωμένο

Οι ιικές αλληλουχίες μπορούν να μεταγραφούν και αυτό, σε ορισμένους ασθενείς
δείγματα, η πλειονότητα των ιικών μεταγραφών φαίνεται να προέρχεται
από ολοκληρωμένες ιογενείς αλληλουχίες.
Αποτελέσματα
Ενσωμάτωση των αλληλουχιών SARS-CoV-2 στο DNA των κυττάρων-ξενιστών
Πολιτισμός. Χρησιμοποιήσαμε τρεις διαφορετικές προσεγγίσεις για την ανίχνευση του γονιδιώματος
Αλληλουχίες SARS-CoV-2 ενσωματωμένες στο γονιδίωμα των μολυσμένων

κύτταρα. Αυτές οι προσεγγίσεις ήταν η μακροχρόνια διαβασμένη αλληλουχία Nanopore, Illu-
mina ζευγαρωμένου άκρου πλήρης γονιδιωματική αλληλουχία και σήμανση Tn5-
βασισμένος σε αλληλουχία εμπλουτισμού θέσης ολοκλήρωσης DNA. Και οι τρεις

μέθοδοι παρείχαν στοιχεία ότι οι αλληλουχίες SARS-CoV-2 μπορούν
να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του κυττάρου ξενιστή.
Για να αυξήσετε την πιθανότητα ανίχνευσης σπάνιων γεγονότων ενσωμάτωσης,
επιμολύναμε κύτταρα HEK293T με πλασμίδια έκφρασης LINE1
πριν από τη μόλυνση με SARS-CoV-2 και απομονωμένο DNA από το
κύτταρα 2 ημέρες μετά τη μόλυνση (Παράρτημα SI, Εικ. S1A). Εμείς εντοπίσαμε
Αντίγραφα DNA των αλληλουχιών νουκλεοκαψιδίου (NC) SARS-CoV-2 σε
τα μολυσμένα κύτταρα με PCR (Παράρτημα SI, Σχήμα S1B) και κλωνοποιήθηκαν τα
πλήρες γονίδιο NC (Παράρτημα SI, Εικ. S1D) από μεγάλο θραύσμα
κυτταρικό γονιδιωματικό DNA που είχε καθαριστεί με πήκτωμα (Παράρτημα SI, Εικ.
S1C). Η αλληλουχία DNA του ιού (NC) επιβεβαιώθηκε από τον Sanger
αλληλουχία (σύνολο δεδομένων S1). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο SARS-CoV-2
Το RNA μπορεί να μεταγραφεί αντίστροφα και το DNA που προκύπτει μπορεί να γίνει
ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του κυττάρου ξενιστή.
Για να αποδειχθεί άμεσα ότι οι αλληλουχίες SARS-CoV-2 ήταν

ενσωματωμένο στο γονιδίωμα του κυττάρου ξενιστή, το DNA που απομονώθηκε από
χρησιμοποιήθηκαν μολυσμένα κύτταρα HEK293T που υπερεκφράζουν LINE1

Αλληλουχία μακράς ανάγνωσης νανοπόρων (Εικ. 1Α). Το Σχ. 1 B–D δείχνει ένα
παράδειγμα μιας πλήρους μήκους ιικής αλληλουχίας υπογονιδιωματικού RNA NC
(1.662 bp) ενσωματώθηκε στο κυτταρικό χρωμόσωμα Χ και πλαισιώθηκε
και στις δύο πλευρές από αλληλουχίες DNA ξενιστή. Σημαντικό, το πλευρικό

Οι αλληλουχίες περιελάμβαναν μια άμεση επανάληψη 20 bp. Αυτός ο ιστότοπος στόχος du-
Η εφαρμογή είναι μια υπογραφή της αναδρομικής ενσωμάτωσης με τη μεσολάβηση LINE1 (41,

42). Ένας άλλος ιικός ενσωματωτής που περιλαμβάνει ένα μερικό υπογονιδιωματικό NC
Αλληλουχία RNA που πλαισιώθηκε από ένα διπλό DNA κυττάρου ξενιστή
Η αλληλουχία στόχου φαίνεται στο Παράρτημα SI, Εικ. S2 A–C. Και στα δύο
περιπτώσεις, οι πλευρικές ακολουθίες περιείχαν μια συναινετική αναγνώριση
αλληλουχία της ενδονουκλεάσης LINE1 (43). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν
ότι οι αλληλουχίες SARS-CoV-2 μπορούν να ενσωματωθούν στα γονιδιώματα

καλλιεργημένων ανθρώπινων κυττάρων με μηχανισμό αναδρομής με τη μεσολάβηση LINE1
ανισμός. Ο Πίνακας 1 συνοψίζει όλους τους συνδεδεμένους SARS-CoV-2-ξενιστή
που ανακτήθηκαν. Αντίγραφα DNA τμημάτων του ιού

γονιδίωμα βρέθηκαν σχεδόν σε όλα τα ανθρώπινα χρωμοσώματα. επιπρόσθετα
στα δύο παραδείγματα που δίνονται στο Σχ. 1 και στο Παράρτημα SI, Σχ. S2,

ανακτήσαμε επίσης κυτταρικές αλληλουχίες για 61 ενσωματωμένους για τους οποίους

μόνο μία από τις δύο συνδέσεις ξενιστή-ιού ανακτήθηκε (SI Ap-
pendix, Σχ. S2 D–F και Πίνακας 1; Το Nanopore διαβάζει που περιέχει το

χιμαιρικές αλληλουχίες που συνοψίζονται στο σύνολο δεδομένων S2). Σημαντικό,
περίπου το 67% των πλευρικών ανθρώπινων αλληλουχιών περιελάμβανε είτε α
συναίνεση ή μια παραλλαγή αλληλουχίας αναγνώρισης ενδονουκλεάσης LINE1
(όπως TTTT/A) (Παράρτημα SI, Εικ. S2 D–F και Πίνακας 1). Αυτά τα

Οι αλληλουχίες αναγνώρισης LINE1 ήταν είτε στη χιμαιρική σύνδεση-
ιώσεις που συνδέονταν άμεσα με το άκρο 3′ (ουρά πολυ-Α) του ιού

ακολουθίες, ή σε απόσταση 8–27 bp από τους κόμβους που
συνδέθηκαν με το 5′ άκρο των ιικών αλληλουχιών, το οποίο βρίσκεται εντός του
πιθανή αντιγραφή ιστότοπου στόχου. Και τα δύο αποτελέσματα είναι συνεπή με το α

μοντέλο στο οποίο η αναδρομή με τη μεσολάβηση LINE1 παρέχει μια μηχανική
ανισμός για την ενσωμάτωση αντιγράφων DNA του υπογονιδιωματικού SARS-CoV-2

θραύσματα στο γονιδιωματικό DNA του ξενιστή. Περίπου το 71% των ιικών παθήσεων
Οι αλληλουχίες πλαισιώθηκαν από ιντρόνια ή διαγονιδιακές κυτταρικές αλληλουχίες

και 29% από εξόνια (Εικ. 1F και Πίνακας 1). Έτσι, η ένωση των
οι ιικές αλληλουχίες με εξόνια είναι πολύ υψηλότερες από ό,τι θα ήταν

αναμένεται για τυχαία ενσωμάτωση στο γονιδίωμα [ανθρώπινο γε-
όνομα: 1,1% εξόνια, 24% εσώνια και 75% διαγονιδιακό DNA (44)],

υποδηλώνει προτιμησιακή ενσωμάτωση σε στόχο που σχετίζεται με εξόνιο
τοποθεσίες. Ενώ προηγούμενες μελέτες δεν έδειξαν προτίμηση για τη LINE1
αναδρομή σε εξόνια (45, 46), τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η LINE1-
η μεσολαβούμενη αναδρομή ορισμένων άλλων RNA μπορεί να είναι διαφορετική. Εμείς
σημείωσε ότι τα όρια ιού-κυττάρου ήταν συχνά κοντά στο 5′
ή 3′ μη μεταφρασμένες περιοχές (UTRs) των κυτταρικών γονιδίων, υποδηλώνοντας
ότι υπάρχει προτίμηση για ενσωμάτωση κοντά σε υποστηρικτές ή
πολυ(Α) τοποθεσίες στο πειραματικό μας σύστημα.

Για να επιβεβαιώσετε την ενσωμάτωση των αλληλουχιών SARS-CoV-2 στο ge-
ονομαστικό DNA με άλλη μέθοδο, υποβάλαμε DNA που απομονώθηκε από

Μολυσμένα με LINE1 και μολυσμένα με SARS-CoV-2 κύτταρα HEK293T σε
Αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος ζευγαρωμένου άκρου Illumina, με χρήση ενός βασισμένου σε Tn5
μέθοδος κατασκευής βιβλιοθήκης (Illumina Nextera) για αποφυγή απολίνωσης
τεχνουργήματα. Οι αναγνώσεις ιικού DNA συγκεντρώθηκαν στο 3′ άκρο του
το γονιδίωμα SARS-CoV-2 (Παράρτημα SI, Εικ. S3). Αναρρώσαμε
17 ιογενείς ενσωματώσεις (άθροισμα δύο αντιγράφων), με χαρτογράφηση ανθρώπου-
ιϊκές χιμαιρικές αλληλουχίες DNA (Εικ. 1 Ε και Πίνακας 2, χιμαιρικό
ακολουθίες που συνοψίζονται στο σύνολο δεδομένων S3). 7 (41%) των κόμβων

περιείχε είτε μια συναίνεση είτε μια παραλλαγή LINE1 αναγνώρισης
αλληλουχίες στις κυτταρικές αλληλουχίες κοντά στη διασταύρωση (Εικ. 1Ε και

Πίνακας 2), σε συμφωνία με μια μηχανική αναδρομή με τη μεσολάβηση LINE1
ανισμός. Παρόμοια με τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την αλληλουχία Nanopore,

περίπου το 76% των ιικών αλληλουχιών πλαισιώθηκαν από εσώνιο ή
διαγονιδιακές κυτταρικές αλληλουχίες και 24% από εξόνια (Εικ. 1F και
Πίνακας 2).
Περίπου το 32% των αλληλουχιών SARS-CoV-2 (ενσωμάτωση 6/21
συμβάντα στο Nanopore, 4/10 σε δεδομένα Illumina) ενσωματώθηκαν στο
ΓΡΑΜΜΕΣ, βραχέα διάσπαρτα πυρηνικά στοιχεία ή μακρύ τερματικό
επαναλάβετε στοιχεία χωρίς στοιχεία για μια τοποθεσία αναγνώρισης LINE1,
υποδηλώνοντας ότι μπορεί να υπάρχει εναλλακτική αντίστροφη μεταγραφή/
μηχανισμός ενσωμάτωσης, πιθανώς παρόμοιος με αυτόν που αναφέρεται για τα κύτταρα
μολυνθεί οξεία με LCMV, που είχε ως αποτέλεσμα την ενσωμάτωση
Αλληλουχίες LCMV συντηγμένες με ενδοκοιλιακό σωματίδιο τύπου Α (IAP)
αλληλουχίες (29).

Για να αξιολογηθεί εάν η γονιδιωματική ενσωμάτωση του SARS-CoV-2 se-
Οι κυήσεις θα μπορούσαν επίσης να εμφανιστούν σε μολυσμένα κύτταρα που δεν υπερέβησαν
εκφράσουμε RT, απομονώσαμε DNA από μολυσμένο με ιό HEK293T και

Κύτταρα Calu3 που δεν επιμολύνθηκαν με έκφραση RT
πλασμίδιο (Εικ. 2Α). Ενσωμάτωση DNA με τη μεσολάβηση της σήμανσης Tn5
αλληλουχία εμπλουτισμού τοποθεσίας (47, 48) (Εικ. 2Β και Παράρτημα SI,
Εικ. S4A) ανίχνευσε συνολικά επτά αλληλουχίες SARS-CoV-2

συντηγμένες σε κυτταρικές αλληλουχίες σε αυτά τα κύτταρα (άθροισμα τριών
εκκρεμείς λοιμώξεις δύο κυτταρικών σειρών), οι οποίες έδειξαν LINE1

αλληλουχίες αναγνώρισης κοντά στον άνθρωπο–SARS-CoV-2 se-
διασταυρώσεις quence (Εικ. 2 Παράρτημα C–F και SI, Εικ. S4 B–D,

χιμαιρικές αλληλουχίες που συνοψίζονται στο σύνολο δεδομένων S4).
Έκφραση ιογενών-κυτταρικών χιμαιρικών μεταγραφών σε μολυσμένα καλλιεργημένα
Κύτταρα και ιστοί που προέρχονται από τον ασθενή. Για να διερευνηθεί η πιθανότητα ότι
Οι αλληλουχίες SARS-CoV-2 που ενσωματώνονται στο γονιδίωμα μπορούν να είναι
εκφράσαμε, αναλύσαμε δημοσιευμένα δεδομένα RNA-seq από
Κύτταρα μολυσμένα με SARS-CoV-2 για ενδείξεις χιμαιρικών μεταγραφών
(49). Εξέταση αυτών των συνόλων δεδομένων (50–55) (Παράρτημα SI, Εικ.

S5) αποκάλυψε έναν αριθμό χιμαιρικών αναγνώσεων ανθρώπου-ιού (SI Ap-
pendix, Σχ. S6 A και B). Αυτά συνέβησαν σε πολλαπλά δείγματα

τύπους, συμπεριλαμβανομένων καλλιεργημένων κυττάρων και οργανοειδών από πνεύμονα/καρδιά/
ιστούς εγκεφάλου/στομάχου (Παράρτημα SI, Εικ. S6B). Η αφθονία των
η χιμαιρική ανάγνωση συσχετίζεται θετικά με το επίπεδο ιικού RNA
σε όλους τους τύπους δειγμάτων (Παράρτημα SI, Εικ. S6B). Χιμαιρικό διαβάζει
γενικά αντιπροσώπευε το 0,004–0,14% του συνολικού SARS-CoV-2
διαβάζει στα δείγματα. Η πλειοψηφία των χιμαιρικών συνδέσεων

χαρτογραφήθηκε με την αλληλουχία του γονιδίου SARS-CoV-2 NC (SI Ap-
pendix, Εικ. S6 C και D). Αυτό συνάδει με τη διαπίστωση ότι

Το NC RNA είναι το πιο άφθονο υπογονιδιωματικό RNA του SARS-CoV-2
(56), καθιστώντας το τον πιο πιθανό στόχο για αντίστροφη μεταγραφή
και ενσωμάτωση. Ωστόσο, πρόσφατα στοιχεία έδειξαν ότι έως και το 1% των

Οι αναγνώσεις RNA-seq από κύτταρα μολυσμένα με SARS-CoV-2 μπορούν να
πραγματικά χιμαιρικό ως αποτέλεσμα της εναλλαγής RT μεταξύ RNA

2 από 10 | PNAS Zhang et al.
https://doi.org/10.1073/pnas.2105968118 Το RNA SARS-CoV-2 με αντίστροφη μεταγραφή μπορεί να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του καλλιεργημένου ανθρώπου
κύτταρα και μπορεί να εκφραστεί σε ιστούς που προέρχονται από τον ασθενή

Κατεβάστηκε στο Πανεπιστήμιο Πατρών στις 19 Μαΐου 2021

Χιμαιρική ανάγνωση «Human-CoV2-human» (Nanopore)
SARS-CoV-2
(1662 bp)
Ο άνθρωπος
(43 bp)

Χιμαιρική ανάγνωση «Human-CoV2-human» (Nanopore)
ευθυγράμμιση στο Human ChrX
chrX: 137.084.400 137.084.600 137.084.800
21,1 q23 q25 q28

TAAGATAATCCAACTTCATTTTTTTCTTCAATTGCTATTGCTTCTTGTCATTCTCTAAGAAGCTATTAAATC
ACATGGGGATAGCACTACTAAAATTAATTTGCATTGAGCTCTTCCATATAGGTGGCTCTCTAACATTGT
……
TTATCAGACATTTAGTTTGTTCGTTTAGAGAACAGATCTACAAGAGATCGAAAGTTGGTTGGTTTGTTA
CCTGGGAAGGTATAAACCTTTAATCGCTATTGCTTCTAAAAGGAAAAAATGAAAACAATTGCAGA…

bp
Ο άνθρωπος
(450 bp)

Ευθυγράμμιση ανάγνωσης Nanopore

—>CCAACT TCA TTTT TCT TCAA T TGCT AT TGCT TCT AAAAGGAAAAA TG

Χιμαιρική ανάγνωση «Human-CoV2-human» (Nanopore)
ευθυγράμμιση στο γονιδίωμα SARS-CoV-2
Κλίμακα
NC_045512v2:
10 kb
10,000 15,000 20,000 25,000

Ευθυγράμμιση ανάγνωσης Nanopore
Γονίδια NCBI από NC_045512.2

ORF1a
ORF1ab

μικρό
ORF3a
ΚΑΙ
Μ
ORF6
ORF7a
ORF7b
ORF8
Ν

ORF10
I II III
—>
10 βάσεις
55 60 65 70 75 80 85
UUGUAGAUCUGUUCUCUAAACGAACUUAAAAUCUGU

—>
10 βάσεις
28,250 28,255 28,260 28,265 28,270 28,275 28,280
GAUUUCAUCUAAACGAACAAACUAAAUGUCUGAUAA
Γονίδια NCBI από NC_045512.2

ORF8 D 119 F 120 I 121 * 122 NM 1 S 2 D 3 N 4
—>
10 βάσεις
29,860 29,865 29,870 29,875 29,880 29,885
CUUCUUAGGAGAAUGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

TRS-L

TRS-B

Εγώ

II

III
Ημέρα:
HEK293T
+ Έκφραση LINE1
1
± SARS-CoV-2
μόλυνση

3
Εξαγωγή DNA κυττάρων
(+RNase)

ΕΝΑ

σι

ντο

ρε

ΚΑΙ

Διπλασιασμός θέσης στόχου και αλληλουχία αναγνώρισης ενδονουκλεάσης LINE1 (TTCT|A)

φά

Διαγονιδιακό
n=18
28.6%
Intron
n=27
42.9%
Exon/UTR
n=18
28.6%
Χιμαιρική διασταύρωση ανθρώπου-CoV2
κατανομή στο ανθρώπινο γονιδίωμα
Χιμαιρικό διάβασμα «Human-CoV2».
(Illumina 2 x 150bp σε ζεύγη):

Νανοπόροι

Αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος
• Νανοπόροι
• Illumina ζευγαρωμένο-άκρο

Κλίμακα
chr12:
500 βάσεις

hg38
85,420,000 85,420,500 85,421,000

Κλίμακα
NC_045512v2:
500 βάσεις
28,900 29,100 29,300 29,500 29,700 29,900
Γονίδια NCBI από NC_045512.2

Ν

ORF10
Ανθρώπινος SARS-CoV-2
Ανθρώπινο Χρ12

SARS-CoV-2
Κλίμακα
chr12:
—>

10 βάσεις
85,420,490 85,420,500 85,420,510 85,420,520
T TCAGGGT TCAAAACCCGCT TCCCA TA TTTTTTTCCTTTCTTTAA
Αλληλουχία αναγνώρισης ενδονουκλεάσης LINE1 (TTTT|C)

Exon/UTR
n=4
23.5%
Διαγονιδιακό
n=4
23.5%
Intron
n=9
53%
Illumina

hg38
0 2

Εικ. 1. Το RNA του SARS-CoV-2 μπορεί να μεταγραφεί αντίστροφα και να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του κυττάρου ξενιστή. (Α) Πειραματική ροή εργασιών. (Β) Χιμαιρική ακολουθία από α
Ανάγνωση αλληλουχίας νανοπόρων που δείχνει την ενσωμάτωση μιας πλήρους μήκους αλληλουχίας υπογονιδιωματικού RNA SARS-CoV-2 NC (ματζέντα) και ανθρώπινων γονιδιωματικών αλληλουχιών (μπλε)
πλαισιώνει και τις δύο πλευρές της ολοκληρωμένης ιικής ακολουθίας. Τα χαρακτηριστικά ενδεικτικά της “αντίστροφης μεταγραφής με εκκίνηση με στόχο” με τη μεσολάβηση LINE1 περιλαμβάνουν την τοποθεσία στόχο
διπλασιασμός (κίτρινη επισήμανση) και η αλληλουχία αναγνώρισης ενδονουκλεάσης LINE1 (υπογραμμισμένη). Εμφανίζονται αλληλουχίες που θα μπορούσαν να χαρτογραφηθούν και στα δύο γονιδιώματα
σε μωβ με αναντιστοιχίες με τις αλληλουχίες του ανθρώπινου γονιδιώματος με πλάγια γράμματα. Τα βέλη υποδεικνύουν τον προσανατολισμό της αλληλουχίας σε σχέση με τον άνθρωπο και τον SARS-CoV-2
γονιδιώματα όπως φαίνεται στα C και D. (Γ) Ευθυγράμμιση του Nanopore που διαβάζεται στο B με το ανθρώπινο γονιδίωμα (χρωμόσωμα X) που δείχνει τη θέση ολοκλήρωσης. Ο άνθρωπος
οι αλληλουχίες στην περιοχή διασταύρωσης δείχνουν τη θέση στόχο, η οποία διπλασιάστηκε όταν ενσωματώθηκε το cDNA του SARS-CoV-2 (κίτρινη επισήμανση) και η LINE1
αλληλουχία αναγνώρισης ενδονουκλεάσης (υπογραμμισμένη). (Δ) Η ευθυγράμμιση του Nanopore που διαβάζεται στο B με το γονιδίωμα SARS-CoV-2 που δείχνει το ενσωματωμένο ιικό DNA είναι
ένα αντίγραφο του πλήρους μήκους NC υπογονιδιωματικού RNA. Οι επισημασμένες με ανοιχτό μπλε περιοχές μεγεθύνονται για να εμφανίσουν τις ακολουθίες TRS-L (I) και TRS-B (II) (υπογραμμισμένες, αυτές είναι
τις αλληλουχίες όπου η ιική πολυμεράση μεταπηδά για να δημιουργήσει το υπογονιδιωματικό RNA) και το τέλος της ιικής αλληλουχίας στην ουρά πολυ(Α) (III). Αυτά τα ιογενή
Τα χαρακτηριστικά αλληλουχίας (I-III) δείχνουν ότι ένα αντίγραφο DNA του πλήρους μήκους NC υπογονιδιωματικού RNA ενσωματώθηκε εκ των υστέρων. (Ε) Ένα ζεύγος ανάγνωσης χιμαιρικού ανθρώπου-ιού από
Αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος ζευγαρωμένου άκρου Illumina. Το ζεύγος ανάγνωσης εμφανίζεται με ευθυγράμμιση με το ανθρώπινο (μπλε) και το γονιδίωμα SARS-CoV-2 (ματζέντα). Τα βέλη
υποδεικνύουν τους προσανατολισμούς ανάγνωσης σε σχέση με το ανθρώπινο γονιδίωμα και το γονιδίωμα SARS-CoV-2. Η τονισμένη (ανοιχτό μπλε) περιοχή της ανθρώπινης χαρτογράφησης ανάγνωσης μεγεθύνεται σε
εμφανίστε την ακολουθία αναγνώρισης LINE1 (υπογραμμισμένη). (ΣΤ) Κατανομές χιμαιρικών συνδέσεων ανθρώπου-CoV2 από την αλληλουχία Nanopore (αριστερά) και Illumina (Δεξιά)
όσον αφορά τα χαρακτηριστικά του ανθρώπινου γονιδιώματος.
Οι Zhang et al. PNAS | 3 από 10
Το αντίστροφο μεταγραφόμενο RNA SARS-CoV-2 μπορεί να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του καλλιεργημένου ανθρώπου
κύτταρα και μπορεί να εκφραστεί σε ιστούς που προέρχονται από τον ασθενή

https://doi.org/10.1073/pnas.2105968118
ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ

Κατεβάστηκε στο Πανεπιστήμιο Πατρών στις 19 Μαΐου 2021

πρότυπα, τα οποία μπορούν να προκύψουν κατά τη διάρκεια του βήματος σύνθεσης cDNA
την παρασκευή μιας βιβλιοθήκης RNA-seq (57). Έτσι, επειδή υπάρχει
ένα μείγμα mRNA ξενιστή και mRNA ιικού θετικού κλώνου σε
μολυσμένα κύτταρα, η ταυτοποίηση γνήσιων χιμαιρικών ιών-
τα κυτταρικά μεταγραφήματα RNA διακυβεύονται από τη δημιουργία του
τεχνητές χίμαιρες στις δοκιμασίες.
Σκεφτήκαμε ότι ο προσανατολισμός ενός ολοκληρωμένου αντιγράφου DNA
του SARS-CoV-2 RNA θα πρέπει να είναι τυχαία σε σχέση με το
προσανατολισμό του στοχευόμενου γονιδίου ξενιστή, προβλέποντας ότι περίπου το μισό
τα ιικά DNA που ενσωματώθηκαν σε ένα εκφρασμένο γονίδιο ξενιστή
πρέπει να είναι σε προσανατολισμό αντίθετο από την κατεύθυνση του ξενιστή
μεταγραφή του κυτταρικού γονιδίου (Εικ. 3Α). Όπως είχε προβλεφθεί, ~50% του ιού

ενσωματωμένους στα ανθρώπινα γονίδια είχαν αντίθετο προσανατολισμό
που σχετίζεται με το γονίδιο ξενιστή στο σύνολο δεδομένων μας Nanopore (ενσωμάτωση στο

ανθρώπινα γονίδια με αλληλουχίες αναγνώρισης LINE1, Εικ. 3Β). Ετσι,
για χιμαιρικές μεταγραφές που προέρχονται από ολοκληρωμένες ιικές αλληλουχίες,
θα περιμέναμε ότι περίπου το 50% των χιμαιρικών μεταγραφών θα έπρεπε
περιέχουν ιικές αλληλουχίες αρνητικού κλώνου συνδεδεμένες με θετικό κλώνο
αλληλουχίες RNA ξενιστή. Προσδιορίσαμε λοιπόν το κλάσμα του

τα χιμαιρικά μεταγράφημα ιού και ανθρώπου-ιού σε μολυσμένα αιμοσφαίρια
τουρισμένα κύτταρα/οργανοειδή και σε ιστούς που προέρχονται από ασθενείς που περιέχουν

ιικές αλληλουχίες RNA αρνητικού κλώνου.
Η αντιγραφή του RNA του SARS-CoV2 απαιτεί τη σύνθεση του

ιικό RNA αρνητικού κλώνου, το οποίο χρησιμεύει ως πρότυπο για αντιγραφή
κατιόν του ιικού γονιδιωματικού RNA και μεταγραφή του ιικού υπο-
RNA θετικού κλώνου γονιδιώματος (21). Για την αξιολόγηση του επιπολασμού του

αρνητικού κλώνου ιικού RNA σε οξεία μολυσμένα κύτταρα, εμείς

προσδιόρισε την αναλογία των συνολικών θετικών προς αρνητικών κλώνων RNA.
Μεταξύ 0 και 0,1% των συνολικών ιικών αναγνώσεων προήλθαν από
RNA αρνητικού κλώνου σε οξεία μολυσμένα κύτταρα Calu3 ή πνεύμονα
οργανοειδή [δεδομένα μας και δημοσιευμένα δεδομένα (50, 58)] (Εικ. 3C και SI
Παράρτημα, Πίνακας S1), παρόμοια με αυτά που έχουν αναφερθεί στην κλινική
δείγματα που ελήφθησαν νωρίς μετά τη μόλυνση (59). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν ότι
το επίπεδο του ιικού RNA αρνητικού κλώνου είναι τουλάχιστον 1.000 φορές χαμηλότερο
από αυτό του ιικού RNA θετικού κλώνου σε οξεία μολυσμένα κύτταρα,
οφείλεται τουλάχιστον εν μέρει στη μαζική παραγωγή θετικού κλώνου
υπογονιδιωματικό RNA κατά την αντιγραφή του ιού. Αυτό μειώνει πολύ
την πιθανότητα τυχαίας εναλλαγής προτύπου κατά την αντίστροφη
βήμα μεταγραφής στην κατασκευή της βιβλιοθήκης RNA-seq
δημιουργούν ένα μεγάλο κλάσμα της τεχνητής χιμαιρικής ανάγνωσης
θα περιέχει RNA αρνητικού κλώνου ιού συντηγμένο με κυτταρικό
θετικές αλληλουχίες RNA. Το προσδιορίσαμε μεταξύ

Το 0 και 1% των χιμαιρικών αναγνώσεων ανθρώπου-ιού περιείχαν αρνητικά
ιικές αλληλουχίες κλώνου στα οξέα μολυσμένα κύτταρα/οργανοειδή

(Εικ. 3D και Παράρτημα SI, Πίνακας S1), σύμφωνα με ένα μικρό
κλάσμα ιικών αναγνώσεων που προέρχονται από ενσωματωμένο SARS-CoV-2
ακολουθίες.
Σε αντίθεση με τα αποτελέσματα που προέκυψαν με οξεία μόλυνση Calu3
κύτταρα ή πνευμονικά οργανοειδή, έως και 51% όλων των ιικών αναγνώσεων και έως
Το 42,5% των χιμαιρικών αναγνώσεων ανθρώπου-ιού προήλθαν από το

RNA αρνητικού κλώνου SARS-CoV-2 σε ορισμένους ιστούς που προέρχονται από ασθενείς
μηνύσεις [δημοσιευμένα δεδομένα (60, 61), κλινικό ιστορικό ασθενών-
σε θέση στις αρχικές δημοσιεύσεις] (Εικ. 3 Παράρτημα E–G και SI,

Πίνακες S2 και S3). Μονοκυτταρική ανάλυση πνεύμονα ασθενούς
Πίνακας 1. Σύνοψη των χιμαιρικών αλληλουχιών ανθρώπου-CoV2 που ελήφθησαν με προσδιορισμό αλληλουχίας DNA Nanpore της μολυσμένης υπερέκφρασης LINE1
Κύτταρα HEK293T
Αριθμός ακολουθιών με
διασταύρωση ανθρώπου-CoV2

Με ακολουθία αναγνώρισης LINE1 στο/κοντά
διασταύρωση (π.χ. TTTT/A)

Διασταύρωση στον άνθρωπο
διαγονιδιακή

Διασταύρωση στο
ανθρώπινο εσώνιο

Διασταύρωση στον άνθρωπο
εξώνιο/UTR
chr1 10 6 0 6 4
chr2 2 2 0 2 0
chr3 3 3 0 3 0
chr4 2 2 0 1 1
chr5 1 1 0 1 0
chr6 4 2 3 0 1
chr7 2 2 1 1 0
chr8 0 0 0 0 0
chr9 4 2 0 2 2
chr10 5 1 2 1 2
chr11 3 2 1 1 1
chr12 6 4 2 2 2
chr13 3 3 3 0 0
chr14 2 2 1 1 0
chr15 0 0 0 0 0
chr16 2 1 1 1 0
chr17 2 0 1 0 1
chr18 2 1 0 2 0
chr19 1 1 0 0 1
chr20 0 0 0 0 0
chr21 2 1 1 1 0
chr22 1 1 0 1 0
chrX 6 5 2 1 3
Σύνολο 63 42 18 27 18
Κλάσμα 66,7% 28,6% 42,9% 28,6%

Πίνακας 2. Σύνοψη των χιμαιρικών αλληλουχιών ανθρώπου-CoV2 που ελήφθησαν από την Illumina ζευγαριού
αλληλουχία DNA ολόκληρου του γονιδιώματος μολυσμένων κυττάρων HEK293T που υπερεκφράζουν LINE1
Χαρακτηριστικά περιοχής (ανθρώπινο) Διαγονιδιακό ιντρόνιο εξόνιο/UTR
Αριθμός περιοχής 4 9 4
Με ακολουθία αναγνώρισης L1 στην/κοντά στη διασταύρωση 2 3 2

4 από 10 | PNAS Zhang et al.
https://doi.org/10.1073/pnas.2105968118 Το RNA SARS-CoV-2 με αντίστροφη μεταγραφή μπορεί να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του καλλιεργημένου ανθρώπου
κύτταρα και μπορεί να εκφραστεί σε ιστούς που προέρχονται από τον ασθενή

ΕΝΑ

σι

ντο

φά
Κυτταρική σειρά Viral primer Αναγνώριση ανθρώπινης LINE1 Ανθρώπινο γονιδιωματικό
χαρακτηριστικό της αλληλουχίας χρωμοσώματος στόχου
HEK293T Κοντά στο 3′ τέλος του Chr15 TTTT|G Intergenic
ιικό γονιδίωμα
Chr1 TTTT|G Intergenic
Calu3 (rep1) Κοντά στο 5′ τέλος του Chr18 CTTT|A Intergenic
γονίδιο NC
Chr2 TTTA|A UTR
Chr12 TTTA|A Intron
Calu3 (rep2) Κοντά στο 5′ τέλος του Chr12 TTTT|C Intron
γονίδιο NC
Chr4 TTTT|A Intron
Περίληψη χιμαιρικής αλληλουχίας Human-CoV2:
Διαβάστε 1 Διαβάστε 2
Χιμαιρική ανάγνωση «Human-CoV2» (HEK293T)
namuH 2-VoC-SARS

CTCAAACAGCCCTGCTTCAACTAGGGGAGAAAACACAGTGTTTGAATACCA
TGTGATGGTATCCATCCTGTTCCAGGTGGAGGATGCAGAGGATGGCCCCCC
TGCACCTTCCAGGATAAGAAGATCCTGATGCAGTCAACTTACCACCAGGA
5’–

–3’

Διαβάστε 1 (151 nt):

5’–

–3’
AGCGGAGTACGATCGAGTGTACAGTGAACAATGCTAGGGAGAGCTGCCTA
TATGGAAGAGCCCTAATGTGTAAAATTAATTTTAGTAGTGCTATCCCCATGT
GATTTTAATAGCTTCTTAGGAGAATGACAAAAAAAAAAAAAAAGAATG
Διαβάστε 2 (151 nt): αστάρι

Χιμαιρική ανάγνωση «Human-CoV2» (HEK293T)
ευθυγράμμιση σε ανθρώπινο Chr15
Κλίμακα
chr15:
500 βάσεις

hg38
68,544,500 68,545,000

Κλίμακα
chr15:
—>
10 βάσεις
68,544,775 68,544,785 68,544,795
CATACACATTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGATG
<— GTATGT GTAAG AAAAAAAAAAAAAAAAAAACTAC

Χιμαιρική ανάγνωση «Human-CoV2» (HEK293T)
ευθυγράμμιση στο γονιδίωμα SARS-CoV-2

Κλίμακα
NC_045512v2:
500 βάσεις
28,900 29,100 29,300 29,500 29,700 29,900
Γονίδια NCBI από NC_045512.2

Ν

ORF10
πρώτα

ρε

ΚΑΙ
Αλληλουχία αναγνώρισης ενδονουκλεάσης LINE1 (TTTT|G)
ΤΤΤ ΤΤΤ ΤΤΤ ΤΤΤ ΤΤΤ ΤΤΤΤ
ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ

SARS-CoV-2 Άνθρωπος

Τυχαία ετικέτα προσαρμογέα
-μνεία από Tn5

Primers

Εμπλουτισμός PCR και
Αλληλουχία ζευγαριού άκρου Illumina

Γονιδίωμα SARS-CoV-2

CGCGGAGTACGATCGAGTG
Ημέρα:
HEK293T ή Calu3
+ Λοίμωξη SARS-CoV-2
1
Εξαγωγή DNA κυττάρων
(+RNase)

Εμπλουτισμός PCR και Illumina
αλληλουχία ζευγών άκρων

0 2

Εικ. 2. Στοιχεία για την ενσωμάτωση του cDNA του SARS-CoV-2 σε καλλιεργημένα κύτταρα που δεν υπερεκφράζουν μια αντίστροφη μεταγραφάση. (Α) Πειραματική ροή εργασιών. (Β) πρώην
περιφερειακός σχεδιασμός για τη μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας εμπλουτισμού με τη μεσολάβηση της επισήμανσης Tn5 που χρησιμοποιείται για τη χαρτογράφηση θέσεων ολοκλήρωσης στο γονιδίωμα του κυττάρου ξενιστή. (Γ) Α

Χιμαιρικό ζεύγος ανάγνωσης ανθρώπου-ιικού που υποστηρίζει την ολοκλήρωση του ιού. Οι αναγνώσεις ευθυγραμμίζονται με τις γονιδιωματικές αλληλουχίες του ανθρώπου (μπλε) και του SARS-CoV-2 (ματζέντα). ο
Τα βέλη υποδεικνύουν τους προσανατολισμούς ανάγνωσης σε σχέση με το ανθρώπινο γονιδίωμα και το γονιδίωμα SARS-CoV-2 όπως φαίνεται στα D και E. Αλληλουχία του ιικού εκκινητή που χρησιμοποιείται για τον εμπλουτισμό
εμφανίζεται με πράσινη επισήμανση στην ανάγνωση (που αντιστοιχεί στο πράσινο βέλος που απεικονίζεται στο Β). Οι αλληλουχίες που θα μπορούσαν να χαρτογραφηθούν και στα δύο γονιδιώματα εμφανίζονται στο
μωβ. (Δ) Ευθυγράμμιση του ζεύγους ανάγνωσης στο C με το ανθρώπινο γονιδίωμα (χρωμόσωμα 15, μπλε βέλος). Η τονισμένη (ανοιχτό μπλε) περιοχή της ανθρώπινης ακολουθίας

μεγεθύνεται για να εμφανίσει την ακολουθία αναγνώρισης LINE1 (υπογραμμισμένη) με μια αλληλουχία poly-dT 19 βάσεων (μωβ επισήμανση) που θα μπορούσε να ανόπτεται από το ιικό πολυ-
Μια ουρά για “αντίστροφη μεταγραφή με εκκίνηση με στόχο”. Πρόσθετη ανθρώπινη ακολουθία 5 bp (GAATG, μπλε) καταγράφηκε στην ανάγνωση 2 (C), υποστηρίζοντας μια καλή πίστη
τοποθεσία τριβής. (Ε) Ευθυγράμμιση του ζεύγους ανάγνωσης στο C με το γονιδίωμα SARS-CoV-2 (ματζέντα). Η αλληλουχία εκκινητών ιών εμφανίζεται με πράσινο χρώμα. (ΦΑ)

Σύνοψη επτά χιμαιρικών αλληλουχιών ανθρώπου-ιού που ταυτοποιήθηκαν με τη μέθοδο εμπλουτισμού αλληλουχίας στις δύο κυτταρικές σειρές που δείχνουν τον ενσωματωμένο άνθρωπο
χρωμοσώματα, αλληλουχίες αναγνώρισης LINE1 κοντά στη χιμαιρική διασταύρωση και ανθρώπινα γονιδιωματικά χαρακτηριστικά στη διασταύρωση ανάγνωσης.
Οι Zhang et al. PNAS | 5 στα 10
Το αντίστροφο μεταγραφόμενο RNA SARS-CoV-2 μπορεί να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του καλλιεργημένου ανθρώπου
κύτταρα και μπορεί να εκφραστεί σε ιστούς που προέρχονται από τον ασθενή

https://doi.org/10.1073/pnas.2105968118
ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ

Κατεβάστηκε στο Πανεπιστήμιο Πατρών στις 19 Μαΐου 2021

Κύτταρα βρογχοκυψελιδικού υγρού πλύσης (BALF) από ασθενείς με
σοβαρή COVID [δημοσιευμένα δεδομένα (61)] έδειξαν ότι έως και το 40% των
όλες οι αναγνώσεις του ιού προήλθαν από τον SARS-CoV-2 αρνητικού σκέλους
RNA (Παράρτημα SI, Εικ. S7). Κλάσματα αρνητικού κλώνου RNA σε
ιστοί από ορισμένους ασθενείς ήταν τάξεις μεγέθους υψηλότεροι από
αυτά σε κύτταρα ή οργανοειδή που έχουν μολυνθεί με οξεία λοίμωξη (Εικ. 3 C–G). Σε σταθερό
(σταθεροποιημένα με φορμαλίνη, ενσωματωμένα σε παραφίνη [FFPE]) δείγματα αυτοψίας, σε 4
από τους 14 ασθενείς (Εικ. 3Ε και Παράρτημα SI, Πίνακας S2) και σε
Δείγματα BALF, σε 4 στους 6 ασθενείς (Εικ. 3G και Παράρτημα SI,

Πίνακας S3), τουλάχιστον ~20% των ιικών αναγνώσεων προήλθαν από
ιικό RNA αρνητικού κλώνου. Σε αντίθεση με τα οξέως μολυσμένα κύτταρα
(Εικ. 3 Γ και Δ και Παράρτημα SI, Πίνακας S1), υπήρχε λίγο ή καθόλου
στοιχεία για την αναπαραγωγή του ιού σε αυτά τα δείγματα αυτοψίας (60). Οπως και
συνοψίζονται στο Παράρτημα SI, Πίνακας S2, υπήρχαν αρνητικούς κλώνους
ιικές αλληλουχίες σε ένα μεγάλο κλάσμα της χιμαιρικής ανθρώπινης-ιικής
μετρήσεις (έως ~40%) σε δείγματα από έναν ασθενή. Διαφορετικός
δείγματα που προέρχονται από τον ίδιο ασθενή αποκάλυψαν παρόμοια υψηλή
κλάσμα αρνητικού κλώνου ιού-ανθρώπινου RNA διαβάζει. Αρκετά

ντο

φά

σι

Περίπτωση ασθενούς

AAAAAA
AAAAAA

RNA-seq:
~ 100% CoV2 διαβάζεται από θετικό σκέλος
Θετικός κλώνος CoV2 (υπο)γονιδιωματικό RNA Τυχαία ολοκλήρωση και μεταγραφή
Ολοκληρωμένο ανθρώπινο γονίδιο CoV2
~50% ίδιος προσανατολισμός: Ο CoV2 διαβάζεται από θετικό σκέλος

ΕΝΑ

ρε
Κλάσμα του χιμαιρικού CoV2
διαβάζει από αρνητικό σκέλος

Κλάσμα του χιμαιρικού CoV2
διαβάζει από αρνητικό σκέλος
Calu3
Οργανοειδές πνεύμονα

Περίπτωση ασθενούς

Κλάσμα του CoV2 διαβάζει
από αρνητικό σκέλος
1 2 3 5 6 7 8 9 10 11 ABCD
0.0001
0.001
0.01
0.1
1

0
0.5

1 8 9 11 CD
0.0001
0.001
0.01
0.1
1

0
0.5
0.0001
0.001
0.01
0.1
1

Κλάσμα του CoV2 διαβάζει

0

από αρνητικό σκέλος
Calu3
Οργανοειδές πνεύμονα
0.0001
0.001
0.01
0.1
1

0

σολ
Το ίδιο Απέναντι
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Σχετικός προσανατολισμός:
Ανθρώπινο γονίδιο vs
ιντεγκρίνη CoV2
Κλάσμα
15
(54%)
13
(46%)

~50% αντίθετος προσανατολισμός: Ο CoV2 διαβάζεται από αρνητικό σκέλος

Το EFraction of CoV2 διαβάζει
από αρνητικό σκέλος
C143
C145
C146
C148
C149
C152

0.0001
0.001
0.01
0.1
1

0
0.5

Περίπτωση ασθενούς

Εικ. 3. Οι αναγνώσεις ιικού RNA-seq αρνητικού κλώνου υποδηλώνουν ότι εκφράζονται ολοκληρωμένες αλληλουχίες SARS-CoV-2. (Α) Σχήμα που προβλέπει κλάσματα θετικού- ή
RNA-seq αρνητικού κλώνου SARS-CoV-2 που προέρχονται από ιικά (υπο)γονιδιωματικά RNA ή από μεταγραφές ολοκληρωμένων ιικών αλληλουχιών. Τα βέλη
(Δεξιά) που δείχνει τον προσανατολισμό ενός ολοκληρωμένου θετικού κλώνου SARS-CoV-2 (ματζέντα) σε σχέση με τον προσανατολισμό του κυτταρικού γονιδίου του ξενιστή (μπλε). (ΣΙ)
Κλάσματα αλληλουχιών SARS-CoV-2 ενσωματωμένες σε ανθρώπινα γονίδια με τον ίδιο (n = 15) ή αντίθετο (n = 13) προσανατολισμό του θετικού κλώνου του ιού σε σχέση με το
θετικό σκέλος του ανθρώπινου γονιδίου. Συνολικά 28 συμβάντα ολοκλήρωσης σε ανθρώπινα γονίδια με αλληλουχίες αναγνώρισης ενδονουκλεάσης LINE1 ταυτοποιήθηκαν από μας
Αλληλουχία DNA νανοπόρου μολυσμένων κυττάρων HEK293T που υπερεκφράζουν LINE1 (Εικ. 1Α). (Γ) Κλάσμα των συνολικών ιικών αναγνώσεων που προέρχονται από αρνητικό κλώνο
ιικό RNA σε οξεία μολυσμένα κύτταρα ή οργανοειδή (βλ. Παράρτημα SI, Πίνακας S1 για λεπτομέρειες). (Δ) Κλάσμα χιμαιρικών αναγνώσεων ανθρώπου-ιού που περιέχουν αλληλουχίες ιών
προέρχεται από ιικό RNA αρνητικού κλώνου σε οξεία μολυσμένα κύτταρα ή οργανοειδή (βλ. Παράρτημα SI, Πίνακας S1 για λεπτομέρειες). (Ε) Κλάσμα των συνολικών ιικών αναγνώσεων που είναι
προέρχεται από ιικό RNA αρνητικού κλώνου σε δημοσιευμένα δεδομένα RNA-seq ασθενών (δειγμάτων FFPE αυτοψίας, GSE150316, δείγματα χωρίς ιικές αναγνώσεις ή χαμηλής βιβλιοθήκης
Δεν περιλαμβάνεται ποιότητα λανθάνουσας κατάστασης. Δείτε το Παράρτημα SI, Πίνακας S2 για λεπτομέρειες. αποτελέσματα επανάλυσης σύμφωνα με την αρχική δημοσίευση). (ΣΤ) Κλάσμα ανθρώπινου ιού
χιμαιρικές αναγνώσεις που περιέχουν ιικές αλληλουχίες που προέρχονται από ιικό RNA αρνητικού κλώνου σε δημοσιευμένα δεδομένα RNA-seq ασθενών (αυτοψία FFPE δείγματα, GSE150316, βλ.
Παράρτημα SI, Πίνακας S2 για λεπτομέρειες). (Ζ) Κλάσμα των συνολικών ιικών αναγνώσεων που προέρχονται από ιικό RNA αρνητικού κλώνου σε δημοσιευμένα δεδομένα RNA-seq ασθενών (BALF
δείγματα, GSE145926; βλέπε Παράρτημα SI, Πίνακας S3 για λεπτομέρειες). Οι κόκκινες διακεκομμένες γραμμές στο E-G υποδεικνύουν το επίπεδο στο οποίο το 50% όλων των ιικών αναγνώσεων (E και G) ή ιογενές
οι αλληλουχίες στις χιμαιρικές αναγνώσεις ανθρώπου-ιού (F) προέρχονταν από ιικά RNA αρνητικού κλώνου, ένα αναμενόμενο επίπεδο εάν όλες οι ιικές αλληλουχίες προέρχονταν από ενσωματωμένα
ακολουθίες.

6 από 10 | PNAS Zhang et al.
https://doi.org/10.1073/pnas.2105968118 Το RNA SARS-CoV-2 με αντίστροφη μεταγραφή μπορεί να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του καλλιεργημένου ανθρώπου
κύτταρα και μπορεί να εκφραστεί σε ιστούς που προέρχονται από τον ασθενή

Κατεβάστηκε στο Πανεπιστήμιο Πατρών στις 19 Μαΐου 2021

άλλα δείγματα ασθενών αποκάλυψαν χαμηλότερο κλάσμα αρνητικού ιού
χίμαιρες κλώνου RNA-ανθρώπινου RNA, οι οποίες, ωστόσο, ήταν ακόμα
σημαντικά υψηλότερο από αυτό που βρέθηκε σε οξεία μολυσμένα κύτταρα
(Εικ. 3 Παράρτημα D και F και SI, Πίνακας S1 και S2). Επειδή η
ικανότητα αναγνώρισης χιμαιρικών αναγνώσεων ιού-ανθρώπου χρησιμοποιώντας σύντομη ανάγνωση
Το RNA-seq είναι περιορισμένο, η ανάλυσή μας απέτυχε να δείξει σημαντική

αριθμοί χιμαιρικών αναγνώσεων σε δείγματα BALF ασθενών (SI Appen-
dix, Πίνακας S3). Συνοπτικά, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι σε ορισμένους ασθενείς-
προερχόμενοι ιστοί, όπου ο συνολικός αριθμός της αλληλουχίας SARS-CoV-2-
Τα θετικά κύτταρα μπορεί να είναι μικρά, ένα μεγάλο κλάσμα των μεταγραφών του ιού

θα μπορούσε να έχει μεταγραφεί από αλληλουχίες SARS-CoV-2
τριμμένο στο γονιδίωμα του ξενιστή.

Συζήτηση
Παρουσιάζουμε εδώ στοιχεία ότι οι αλληλουχίες SARS-CoV-2 μπορεί να είναι
αντίστροφη μεταγραφή και ενσωμάτωση στο DNA των μολυσμένων
ανθρώπινα κύτταρα σε καλλιέργεια. Για δύο από τους ενσωματωμένους, ανακάμψαμε
Το χιμαιρικό «άνθρωπος-ιός-ανθρώπινος» διαβάζεται που περιλαμβάνει ένα άμεσο
επανάληψη τοποθεσίας στόχου (20 ή 13 bp) και μια τοποθεσία αναγνώρισης συναίνεσης
της ενδονουκλεάσης LINE1 υπήρχε και στα δύο άκρα του ξενιστή
DNA που πλαισιώνει τις ιογενείς αλληλουχίες. Αυτά και άλλα δεδομένα είναι

συμβατή με μια αρχική αρχική αντίστροφη μεταγραφή και ρετρό
μηχανισμός ολοκλήρωσης θέσης (41, 42) και προτείνουμε ότι
Η δογματική LINE1 RT μπορεί να εμπλέκεται στην αντίστροφη μεταγραφή

και ενσωμάτωση αλληλουχιών SARS-CoV-2 στα γονιδιώματα του
μολυσμένα κύτταρα.
Περίπου το 30% των ενσωματωμένων ιών αναλύθηκαν σε καλλιέργεια

κύτταρα δεν είχαν αναγνωρίσιμη γειτονική ενδονουκλεάση LINE1
ιστοσελίδα nition. Έτσι, είναι επίσης πιθανό ότι η ενοποίηση μπορεί να συμβεί με

άλλον μηχανισμό. Πράγματι, υπάρχουν ενδείξεις ότι χιμαιρικό
Τα cDNA μπορούν να παραχθούν σε κύτταρα οξεία μολυσμένα με LCMV από
επιλογή αντιγραφής με ενδογενή στοιχεία IAP κατά την αντίστροφη
μεταγραφή. Αυτός ο μηχανισμός αναμένεται να δημιουργήσει μια χιμαιρική
cDNA συμπληρωματικό τόσο του LCMV όσο και του IAP. Σε ορισμένες περιπτώσεις,

τα προκύπτοντα χιμαιρικά cDNA ενσωματώθηκαν χωρίς το γονίδιο
επανάληψη μιας τοποθεσίας στόχου (29). Μια πρόσφατη μελέτη επίσης

πρότεινε ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ των αλληλουχιών του κορωνοϊού

και το ενδογενές ρετροτρανσποζόνιο θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός ιικός
μηχανισμός ενσωμάτωσης (40).

Θα είναι σημαντικό, σε μελέτες παρακολούθησης, να αποδειχθεί η
παρουσία αλληλουχιών SARS-CoV-2 ενσωματωμένων στον ξενιστή
γονιδίωμα στους ιστούς ασθενών. Ωστόσο, αυτό θα είναι τεχνικά
πρόκληση γιατί μόνο ένα μικρό κλάσμα κυττάρων σε κάθε ασθενή
Οι ιστοί αναμένεται να είναι θετικοί για ιικές αλληλουχίες (61).

Σύμφωνα με αυτή την ιδέα, έχει υπολογιστεί ότι μόνο
μεταξύ 1 στα 1.000 και 1 στα 100.000 κύτταρα ποντικού που έχουν μολυνθεί με

Το LCMV είτε σε καλλιέργεια είτε στο ζώο έφερε ιικό DNA
αντίγραφα ενσωματωμένα στο γονιδίωμα (30). Επιπλέον, μόνο α
κλάσμα ασθενών μπορεί να φέρει ενσωματωμένες αλληλουχίες SARS-CoV-2
στο DNA ορισμένων κυττάρων. Ωστόσο, με περισσότερα από 140 εκατ
άνθρωποι που έχουν μολυνθεί με SARS-CoV-2 παγκοσμίως (από τον Απρίλιο,
2021), ακόμη και ένα σπάνιο συμβάν θα μπορούσε να είναι σημαντικής κλινικής σημασίας.

Είναι επίσης δύσκολο να εκτιμηθεί η συχνότητα των αναδρομικών
συμβάντα ολοκλήρωσης σε προσδιορισμούς κυτταροκαλλιέργειας αφού τα μολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιούν
συμμαχούν και χάνονται πριν από τη συλλογή του δείγματος. Για το ίδιο

λόγο, δεν αναμένεται κλωνική επέκταση των ενσωματωμένων κυττάρων
πειράματα οξείας μόλυνσης. Επιπλέον, η πιθανότητα ένταξης
στον ίδιο γονιδιωματικό τόπο σε διαφορετικούς ασθενείς/ιστούς μπορεί να είναι
χαμηλό, λόγω μιας τυχαίας διαδικασίας ολοκλήρωσης.
Η παρουσία χιμαιρικών RNA ιού-ξενιστή στα κύτταρα δεν μπορεί
μόνο να ληφθεί ως ισχυρή απόδειξη για τη μεταγραφή του ολοκληρωμένου
ιογενείς ακολουθίες επειδή η εναλλαγή προτύπου μπορεί να συμβεί κατά τη διάρκεια
το στάδιο της αντίστροφης μεταγραφής της προετοιμασίας της βιβλιοθήκης cDNA.
Ωστόσο, διαπιστώσαμε ότι μόνο ένα πολύ μικρό κλάσμα (0–1%) των

χιμαιρικές αναγνώσεις από οξεία μολυσμένα κύτταρα περιείχαν αρνητικά
αλληλουχίες ιικού RNA κλώνου, ενώ στις βιβλιοθήκες RNA-seq

που παρασκευάστηκε από ορισμένους ασθενείς, το κλάσμα των συνολικών ιικών αναγνώσεων,
και το κλάσμα των χιμαιρικών αναγνώσεων ανθρώπου-ιού που προέκυψαν

από RNA αρνητικού κλώνου SARS-CoV-2 ήταν ουσιαστικά
πιο ψηλά. Για συμβάντα ολοκλήρωσης με μεσολάβηση ρετροτρανσποζονίων, το
ο προσανατολισμός του ανάστροφου μεταγραφόμενου RNA του SARS-CoV-2 θα πρέπει
να είναι τυχαία σε σχέση με τον προσανατολισμό ενός γονιδίου ξενιστή. Ετσι,
για χιμαιρικά RNA που προέρχονται από ολοκληρωμένες ιικές αλληλουχίες,
περίπου οι μισές από τις χιμαιρικές αναγνώσεις θα συνδέσουν τον ξενιστή θετικού κλώνου
Αλληλουχίες RNA προς ιικές αλληλουχίες αρνητικού κλώνου. Σε ορισμένες
δείγματα ασθενών, ελήφθησαν υπόψη αναγνώσεις ιού αρνητικού σκέλους
40–50% των συνολικών αλληλουχιών ιικού RNA και ένα παρόμοιο κλάσμα

των χιμαιρικών αναγνώσεων περιείχαν ιικό RNA αρνητικού κλώνου se-
υποδηλώνοντας ότι η πλειονότητα, αν όχι όλα τα ιικά RNA

σε αυτά τα δείγματα προήλθαν από ενσωματωμένες ιικές αλληλουχίες.
Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι, επειδή έχουμε εντοπίσει μόνο
υπογονιδιωματικές αλληλουχίες που προέρχονται κυρίως από το 3′ άκρο του
ιικό γονιδίωμα ενσωματωμένο στο DNA του κυττάρου ξενιστή, μολυσματικό
ο ιός δεν μπορεί να παραχθεί από τέτοιο ενσωματωμένο υπογονιδιωματικό

Αλληλουχίες SARS-CoV-2. Η πιθανότητα να εμφανιστεί ο SARS-CoV-2
Οι ουρές μπορούν να ενσωματωθούν στο ανθρώπινο γονιδίωμα και να εκφραστούν

με τη μορφή χιμαιρικών RNA εγείρει πολλά ερωτήματα για το μέλλον
σπουδές. Οι ολοκληρωμένες αλληλουχίες SARS-CoV-2 εκφράζουν ιούς
αντιγόνα σε ασθενείς και ενδέχεται να επηρεάσουν την κλινική πορεία
της ασθένειας; Τα διαθέσιμα κλινικά στοιχεία υποδηλώνουν ότι, στο
Τα περισσότερα, μόνο ένα μικρό κλάσμα των κυττάρων στους ιστούς των ασθενών εκφράζονται

ιικές πρωτεΐνες σε επίπεδο που είναι ανιχνεύσιμο με ανοσοϊστο-
χημεία. Ωστόσο, εάν ένα κελί με μια ολοκληρωμένη και εκφρασμένη

Οι αλληλουχίες SARS-CoV-2 επιβιώνουν και παρουσιάζουν ιογενή ή νεο-
αντιγόνο μετά την εκκαθάριση της λοίμωξης, αυτό μπορεί να προκαλέσει
αδιάκοπη διέγερση της ανοσίας χωρίς να προκαλεί λοιμώδη

ιού και θα μπορούσε να προκαλέσει μια προστατευτική απόκριση ή καταστάσεις όπως
ως αυτοάνοση όπως έχει παρατηρηθεί σε ορισμένους ασθενείς (62, 63).
Η παρουσία αλληλουχιών LCMV ενσωματωμένων στα γονιδιώματα του
οξεία μολυσμένα κύτταρα σε ποντίκια οδήγησαν τους συγγραφείς να υποθέσουν ότι
έκφραση τέτοιων ακολουθιών «δυνητικά αντιπροσωπεύει μια φυσικά
παραγόμενη μορφή εμβολίου DNA» (30). Δεν είναι γνωστό πόσα
Τα κύτταρα που παρουσιάζουν αντιγόνο χρειάζονται για να προκληθεί μια απόκριση αντιγόνου,
αλλά αποκατασταλμένη έκφραση LINE1, που προκαλείται από ιογενή λοίμωξη ή
με έκθεση σε κυτοκίνες (38–40), μπορεί να διεγείρει τον SARS-CoV-2
ενσωμάτωση στο γονιδίωμα των μολυσμένων κυττάρων σε ασθενείς. Περισσότερο
γενικά, τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι η ενσωμάτωση του ιικού DNA σε
Τα σωματικά κύτταρα μπορεί να αντιπροσωπεύουν συνέπεια μιας φυσικής μόλυνσης

που θα μπορούσε να παίξει ρόλο στις επιπτώσεις άλλων κοινών νόσων-
προκαλούν ιούς RNA όπως ο δάγκειος πυρετός, ο Ζίκα ή ο ιός της γρίπης.

Τα αποτελέσματά μας μπορεί επίσης να είναι σχετικά με τις τρέχουσες κλινικές δοκιμές
αντιικές θεραπείες (64). Αν ενσωμάτωση και έκφραση ιογενούς
Τα RNA είναι αρκετά κοινά, βασίζονται σε εξαιρετικά ευαίσθητη PCR
δοκιμές για τον προσδιορισμό της επίδρασης των θεραπειών στην αντιγραφή του ιού
και το ιικό φορτίο μπορεί να μην αντικατοπτρίζει πάντα την ικανότητα της θεραπείας
για την πλήρη καταστολή της αντιγραφής του ιού επειδή οι δοκιμές PCR μπορεί
ανιχνεύουν ιικές μεταγραφές που προέρχονται από αλληλουχίες DNA ιού
που έχουν ενσωματωθεί σταθερά στο γονιδίωμα παρά
μολυσματικός ιός.
Υλικά και μέθοδοι
Κυτταρική καλλιέργεια και πλασμιδιακή επιμόλυνση. Τα κύτταρα ΗΕΚ293Τ ελήφθησαν από ATCC
(CRL-3216) και καλλιεργήθηκε σε DMEM συμπληρωμένο με 10% αδρανοποιημένο με θερμότητα
FBS (HyClone; SH30396.03) και 2 mM L-γλουταμίνη (MP Biomedicals;
IC10180683) ακολουθώντας τη μέθοδο του ATCC. Τα κύτταρα Calu3 ελήφθησαν από ATCC
(HTB-55) και καλλιεργήθηκε σε ΕΜΕΜ (ATCC; 30-2003) συμπληρωμένο με 10%
αδρανοποιημένο με θερμότητα FBS (HyClone; SH30396.03) σύμφωνα με τη μέθοδο ATCC.
Πλασμίδια για έκφραση ανθρώπινης LINE1, pBS-L1PA1-CH-mneo (CMV-LINE-1),
ήταν ένα δώρο από την Astrid Roy-Engel, το Κέντρο Επιστημών Υγείας του Πανεπιστημίου Tulane,
Νέα Ορλεάνη, LA (Addgene πλασμίδιο #51288; http://addgene.org/51288;
RRID:Addgene_51288) (65); Το EF06R (5′UTR-LINE-1) ήταν ένα δώρο από την Eline
Luning Prak, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA (Addgene πλασμίδιο
#42940 ; http://addgene.org/42940; RRID:Addgene_42940) (66). Μεταμόλυνση
έγινε με Lipofectamine 3000 (Invitrogen; L3000001) μετά
πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Οι Zhang et al. PNAS | 7 από 10
Το αντίστροφο μεταγραφόμενο RNA SARS-CoV-2 μπορεί να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του καλλιεργημένου ανθρώπου
κύτταρα και μπορεί να εκφραστεί σε ιστούς που προέρχονται από τον ασθενή

https://doi.org/10.1073/pnas.2105968118
ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ

Κατεβάστηκε στο Πανεπιστήμιο Πατρών στις 19 Μαΐου 2021

Λοίμωξη SARS-CoV-2. SARS-CoV-2 USA-WA1/2020 (GenBank: MN985325.1)
ελήφθη από την BEI Resources και επεκτάθηκε και τιτλοποιήθηκε σε κύτταρα Vero.
Τα κύτταρα μολύνθηκαν σε DMEM συν 2% FBS για 48 ώρες χρησιμοποιώντας ένα πλήθος
μόλυνση (MOI) 0,5 για μόλυνση των κυττάρων HEK293T και MOI 1 ή 2 για
Κύτταρα Calu3. Όλη η επεξεργασία και η συγκομιδή του δείγματος με μολυσματικό ιό έγιναν
έγινε στις εγκαταστάσεις BSL3 στο Ινστιτούτο Ragon.
Nucleic Acids Extraction and PCR Assay. Η εξαγωγή κυτταρικού DNA έγινε χρησιμοποιώντας
δημοσιευμένη μέθοδος (31). Για καθαρισμό γονιδιωματικού DNA, ολικού κυτταρικού DNA
κλασματοποιήθηκε σε πήκτωμα αγαρόζης 0,4% (wt/vol)/1× TAE για 1,5 ώρα με 3 V/cm
τάσης, με λ DNA-HindIII Digest (NEB; N3012S) ως δείκτες μεγέθους. Μεγάλο
θραύσματα (>23,13 kb) κόπηκαν, καταψύχθηκαν στους -80 °C και στη συνέχεια συνθλίφθηκαν με
ρύγχος πιπέτας. Τρεις όγκοι (vol/wt) ρυθμιστικού διαλύματος υψηλής ΤΕ (10 mM Tris–10 mM

Προστέθηκε EDTA, pH 8,0) και στη συνέχεια προστέθηκε NaCl για να δώσει μια τελική συγκέντρωση
μέτρηση 200 mM. Το διάλυμα γέλης θερμάνθηκε στους 70°C για 15 λεπτά με

συνεχής ανάμιξη και στη συνέχεια εκχυλίζεται με φαινόλη:χλωροφόρμιο:ισοαμυλική αλκοόλη

(25:24:1, vol/vol/vol) (Life Technologies; 15593031) και χλωροφόρμιο:ισοαμυλ αλ-
cohol 24:1 (Sigma; C0549-1PT). Το DNA κατακρημνίστηκε με την προσθήκη
οξικό νάτριο και ισοπροπυλική αλκοόλη. Για δείγματα με χαμηλή συγκέντρωση DNA,

γλυκογόνο (Life Technologies; 10814010) προστέθηκε ως φορέας για να βοηθήσει
κατακρήμνιση.
Η εξαγωγή RNA έγινε με RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen; 74034)
ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Για να ανιχνεύσουμε αντίγραφα DNA των αλληλουχιών SARS-CoV-2, επιλέξαμε τέσσερα γονίδια NC-
στόχευση σετ εκκινητών PCR που χρησιμοποιούνται σε τεστ COVID-19 [Παράρτημα SI, Εικ.

S1A, πηγή εκκινητή από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (67), τροποποιημένο για να ταιριάζει
την έκδοση γονιδιώματος του NC_045512.2]. Βλέπε Παράρτημα SI, Πίνακας S4 για PCR
ακολουθίες εκκινητών που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη. Η PCR έγινε χρησιμοποιώντας AccuPrime Taq DNA
Πολυμεράση, υψηλής πιστότητας (Life Technologies; 12346094). Τα προϊόντα PCR ήταν
τρέξτε σε πήκτωμα αγαρόζης 1% ή 2% (wt/vol) για να δείξετε ενισχύσεις.
Αλληλουχία και Ανάλυση DNA νανοπόρου. Συνολικά εξήχθησαν 1,6 μg DNA
από κύτταρα HEK293T επιμολυσμένα με το pBS-L1PA1-CH-mneo (CMV-LINE-1)

πλασμίδιο και μολυσμένο με SARS-CoV-2 χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία αλληλουχίας λι-
με το κιτ SQK-LSK109 (Oxford Nanopore Technologies) και
διακόπηκε σε ένα κύτταρο ροής R9 PromethION (FLO-PRO002) για 3 ημέρες και 5 λεπτά.

Τα δεδομένα αλληλουχίας κλήθηκαν με βάση χρησιμοποιώντας Guppy 4.0.11 (Oxford Nanopore
Τεχνολογίες) χρησιμοποιώντας το μοντέλο υψηλής ακρίβειας.

Οι αναγνώσεις Nanopore χαρτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας minimap2 (68) (έκδοση 2.15) με pa-
rameters “-p 0.3 -ax map-ont” και ένα αρχείο fasta που περιέχει το ανθρώπινο γονιδίωμα

ακολουθία από την έκδοση 93 ENSEMBL (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-93/fasta/

homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz) concat-
ενσωματώνεται στην ακολουθία SARS-CoV-2, GenBank ID: MN988713.1, «Σοβαρή οξεία

respiratory syndrome coronavirus 2 isolate SARS-CoV-2/human/USA/IL-CDC-IL1/
2020, complete genome.” From the SAM file, we selected all the sequences that

χαρτογραφήθηκαν στο γονιδίωμα του ιού και τα χωρίστηκαν σε ομάδες με βάση το ανθρώπινο
man chromosomes they mapped to. We blasted the selected sequences, using

blastn, έναντι μιας βάσης δεδομένων BLAST που δημιουργήθηκε με τις αλληλουχίες ανθρώπου και ιού
περιγράφεται παραπάνω. Αναλύσαμε την έξοδο blast σε ένα αρχείο κειμένου που περιέχει μία σειρά

ανά ζεύγος τμημάτων υψηλής βαθμολογίας (HSP) με προσαρμοσμένο σενάριο perl. Συμπληρώνουμε περαιτέρω
έριξε αυτό το αρχείο, για κάθε ακολουθία, επιλέγοντας όλα τα ιογενή HSP και το επάνω μέρος

τρία ανθρώπινα HSP. Επιθεωρήσαμε αυτά τα αρχεία οπτικά για να αναγνωρίσουμε τις ακολουθίες
που περιέχει συνδέσμους ανθρώπου-ιού-ανθρώπου ή ανθρώπου-ιού. Για μερικές σεκάνς,

μεγαλύτερο από 30 kb, επιθεωρήσαμε τα κορυφαία 15 ανθρώπινα HSP. Επιπλέον, εμείς vi-
επιθεώρησε συνήθως όλες τις αναγνωρισμένες αναγνώσεις που περιείχαν ανθρώπινες και ιικές αλληλουχίες

από το εργαλείο BLAT (69) του Πανεπιστημίου της Καλιφόρνια, Santa Cruz (UCSC). Λόγω λαθών
σε αλληλουχία Nanpore και/ή βασική κλήση, τεχνητές “υβριδικές ακολουθίες”
υπάρχουν σε ένα υποσύνολο αυτών των αναγνώσεων, μερικές φορές με σκέλη Watson και Crick από
το ίδιο θραύσμα DNA που υπάρχει στην ίδια ανάγνωση. Ως εκ τούτου, εστιάσαμε μόνο
σε χιμαιρικές αλληλουχίες που δείχνουν σαφείς συνδέσεις ανθρώπου-ιού και αναλύθηκαν
γνωστά χαρακτηριστικά επανατοποθέτησης με τη μεσολάβηση LINE1, όπως αντιγραφές στόχων τοποθεσίας
και αλληλουχίες αναγνώρισης ενδονουκλεάσης LINE1 για ενδείξεις ολοκλήρωσης.

Εμπλουτισμός ιστότοπου ενσωμάτωσης μέσω ετικετών Tn5. Χρησιμοποιήσαμε μια ετικετοποίηση-
βασισμένη μέθοδος εμπλουτισμού για θέσεις ενσωμάτωσης ιών (47, 48). Εν συντομία, χρησιμοποιήσαμε Tn5

τρανσποζάση (Diagenode; C01070010) για την τυχαία επισήμανση του κυτταρικού DNA
με προσαρμογείς (προσαρμογέας Α, σύστημα Illumina Nextera). Έγινε ετικετοποίηση
χρησιμοποιώντας 100 ng DNA για 10 λεπτά στους 55 °C, ακολουθούμενο από αφαίρεση του Tn5
τρανσποτάση από το DNA με SDS. Χρησιμοποιήσαμε ένα αντίστροφο αστάρι που στοχεύει το
κοντά στο 5′ τέλος του γονιδίου SARS-CoV-2 NC (CCAAGACGCAGTATTATTGGGTAAA) ή

μπροστινό εκκινητή που στοχεύει το σχεδόν 3′ άκρο του γονιδιώματος SARS-CoV-2 (CTTGTGCAG-
AATGAATTCTCGTAACT) για γραμμική ενίσχυση (PCR0, 45 κύκλοι) του επισημασμένου DNA

θραύσματα που περιέχουν ιικές αλληλουχίες. Πήραμε το προϊόν της PCR0 και αμ-
πολλαπλασιάστηκε τα θραύσματα DNA που περιέχουν αλληλουχίες προσαρμογέα και ιούς (δυνατ

τοποθεσίες ολοκλήρωσης) χρησιμοποιώντας 15–20 κύκλους PCR1, με γραμμικό κώδικα (i5) Nextera primer

(AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACNNNNNNNTCGTCGGCAGCGTC,
Το NNNNNNNN υποδεικνύει τον γραμμωτό κώδικα) έναντι της ακολουθίας προσαρμογέα και ενός ιού
αλφαβητάρι. Ο ιικός εκκινητής σχεδιάστηκε είτε για να στοχεύει στο άκρο σχεδόν 5′
Γονίδιο SARS-CoV-2 NC (GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGCCGAC
GTTGTTTTGATCG, ιική αλληλουχία υπογραμμισμένη) ή στοχεύστε το σχεδόν 3′ τέλος του
Γονιδίωμα SRAS-CoV-2 (GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCGCGGA
GTACGATCGAGTG, ιική αλληλουχία υπογραμμισμένη). Ο ιικός εκκινητής περιείχε επίσης
μια ακολουθία προσαρμογέα για περαιτέρω ενίσχυση PCR. Ενισχύσαμε την PCR1
προϊόν με 15–20 κύκλους PCR2, χρησιμοποιώντας ένα βραχύ αστάρι (AATGATACGGGCGACCACC
GA) έναντι της αλληλουχίας εκκινητών i5 Nextera και ενός εκκινητή με γραμμικό κώδικα (i7) Nextera
(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNGTCTCGTGGGCTCGG,
Το NNNNNNNN υποδεικνύει τον γραμμωτό κώδικα) έναντι της ακολουθίας προσαρμογέα που εισάγεται από

τον ιικό εκκινητή στην PCR1. Το τελικό προϊόν της ενίσχυσης PCR2 ήταν κλάσμα
με 1,5% γέλη αγαρόζης (Sage Science, HTC1510) με PippinHT (Sage

Επιστήμη; HTP0001) και τεμάχια 500 έως 1.000 bp επιλέχθηκαν για ζεύγη Illumina
τελική αλληλουχία. Και τα τρία βήματα PCR (PCR0–PCR2) έγιναν με KAPA HiFi

HotStart ReadyMix (KAPA;KK2602).
Αλληλουχία και Ανάλυση DNA Illumina. Κατασκευάσαμε βιβλιοθήκες για το κελί HEK293T

αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος χρησιμοποιώντας το κιτ προετοιμασίας DNA Illumina με βάση το Tn5 (Illu-
μίνα? 20018704). Οι βιβλιοθήκες αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος ή οι βιβλιοθήκες από

Ο εμπλουτισμός θέσης ολοκλήρωσης με τη μεσολάβηση Tn5 μετά τον προσδιορισμό του μεγέθους (που περιγράφεται παραπάνω).

υποβάλλονται σε αλληλουχία Illumina. Χρησιμοποιήθηκε qPCR για τη μέτρηση της συγκέντρωσης
θέσεις κάθε βιβλιοθήκης χρησιμοποιώντας το κιτ ποσοτικής βιβλιοθήκης KAPA qPCR σύμφωνα με το

πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Στη συνέχεια οι βιβλιοθήκες συγκεντρώθηκαν σε ισομοριακές συγκεντρώσεις
για κάθε λωρίδα, με βάση τις συγκεντρώσεις qPCR. Οι συγκεντρωμένες βιβλιοθήκες ήταν

μετουσιώθηκε χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο Illumina. Φορτώθηκαν οι μετουσιωμένες βιβλιοθήκες
σε μια κυψέλη ροής SP σε ένα Illumina NovaSeq 6000 και τρέξτε για 2 × 150 κύκλους
σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Δημιουργήθηκαν αρχεία Fastq και
αποπολυπλέξη με το λογισμικό μετατροπής bcl2fastq (Illumina).
Για τον εντοπισμό αναγνώσεων χιμαιρικού DNA ανθρώπου–SARS-CoV-2, οι ακατέργαστες αναγνώσεις αλληλουχίας έγιναν
ευθυγραμμισμένο με το STAR (70) (έκδοση 2.7.1a) σε γονιδίωμα ανθρώπου συν SARS-CoV-2
με ένα αρχείο fasta που περιέχει την έκδοση hg38 της ακολουθίας ανθρώπινου γονιδιώματος με αρ
εναλλακτικά χρωμοσώματα που συνδέονται με την αλληλουχία SARS-CoV-2 από την National
Ακολουθία αναφοράς Κέντρου Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας (NCBI) NC_045512.2. ο
Οι ακόλουθες παράμετροι STAR χρησιμοποιήθηκαν για την κλήση χιμαιρικών αναγνώσεων: –alignIntronMax 1
\–ChimOutType Junctions SeparateSAMold WithinBAM HardClip
\–chimScoreJunctionNonGTAG 0 \–alignSJstitchMismatchNmax -1–1 -1–1
\–chimSegmentMin 25 \–chimJunctionOverhangMin 25 \–outSAMtype
BAM SortedByCoordinate. Εξάγαμε ιογενείς αναγνώσεις από τα δημιουργημένα
Αρχείο BAM από samtools (71) (έκδοση 1.11) χρησιμοποιώντας την εντολή: samtools view -b

Aligned.sortedByCoord.out.bam NC_045512v2 > NC_Aligned.sortedBy-
Coord.out.bam. Εξάγαμε χιμαιρικές αναγνώσεις ανθρώπου-ιού χρησιμοποιώντας την ανάγνωση

ονόματα από το αρχείο Chimeric.out.junction που δημιουργήθηκε από το STAR για να λάβετε την ανάγνωση
ευθυγραμμίσεις από το αρχείο Chimeric.out.sam που δημιουργήθηκε από το STAR από την Picard (http://

broadinstitute.github.io/picard), χρησιμοποιώντας την εντολή: java -jar picard.jar Filter-
SamReads I = Chimeric.out.sam O = hv-Chimeric.out.sam READ_LIST_FILE = hv-
Chimeric.out.junction.ids ΦΙΛΤΡΟ = includeReadList. Επιβεβαιώσαμε περαιτέρω το καθένα

από τις χιμαιρικές αναγνώσεις και φιλτράρονται τυχόν μη πειστικές αναγνώσεις (πολύ σύντομες ή
ευθυγραμμισμένο σε πολλαπλές θέσεις του ανθρώπινου γονιδιώματος) με οπτική επιθεώρηση με
το εργαλείο UCSC BLAT (69). Φορτώσαμε επίσης το STAR που δημιουργήθηκε στο Aligned.-
αρχείο sortedByCoord.out.bam ή το αρχείο NC_Aligned.sortedByCoord.out.bam
που περιέχει εξαγόμενες αναγνώσεις ιών στο γονιδίωμα του προγράμματος περιήγησης UCSC SARS-CoV-2
(NC_045512.2) για αναζήτηση πρόσθετων χιμαιρικών αναγνώσεων που παραλείφθηκαν
τη χιμαιρική μέθοδο κλήσης STAR. Για να δημιουργήσουμε αρχείο κάλυψης γονιδιώματος, εμείς
χρησιμοποίησε το bamCoverage από τη σουίτα deepTools (72) (έκδοση 3.5.0) για τη μετατροπή
το STAR δημιούργησε το αρχείο Aligned.sortedByCoord.out.bam σε ένα αρχείο bigwig δεσμευμένο
στα 10 bp, χρησιμοποιώντας την εντολή: bamCoverage -b Aligned.sortedByCoord.out.bam -o
Aligned.sortedByCoord.out.bw–binSize 10.

RNA-Seq and Analysis. Για να προσδιορίσετε τις χιμαιρικές αναγνώσεις του ανθρώπου–SARS-CoV-2, δημοσιεύστε
Τα δεδομένα RNA-seq λήφθηκαν από το Gene Expression Omnibus

(GEO) με τους αριθμούς πρόσβασης GSE147507 (50), GSE153277 (51),
GSE156754 (52), GSE157852 (53), GSE153684 (54) και GSE154998 (55)
(συνοψίζεται στο Παράρτημα SI, Εικ. S5C). Οι πρωτογενείς αναγνώσεις αλληλουχίας ευθυγραμμίστηκαν με
STAR (70) (έκδοση 2.7.1a) σε ανθρώπινο γονιδίωμα και SARS-CoV-2 και μεταγραφικό
κατασκευασμένο με ένα αρχείο fasta που περιέχει την έκδοση της ακολουθίας του ανθρώπινου γονιδιώματος hg38 με
δεν υπάρχουν εναλλακτικά χρωμοσώματα που συνδέονται με την αλληλουχία SARS-CoV-2 από το NCBI

αλληλουχία αναφοράς NC_045512.2 και ένα αρχείο gtf που περιέχει το ανθρώπινο γονίδιο an-
σημειώσεις από την έκδοση ENSEMBL GRCh38.97 που συνδέονται με το SARS-CoV-2

σχολιασμοί γονιδίων από το NCBI (http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/wuh-
Cor1/bigZips/γονίδια/). Οι ακόλουθες παράμετροι STAR (56) χρησιμοποιήθηκαν για την κλήση του chi-
Το meric διαβάζει εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά (Παράρτημα SI, Εικ. S5C):–chimOutType

Junctions SeparateSAMold WithinBAM HardClip \–chimScoreJunctionNonGTAG
8 από 10 | PNAS Zhang et al.
https://doi.org/10.1073/pnas.2105968118 Το RNA SARS-CoV-2 με αντίστροφη μεταγραφή μπορεί να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του καλλιεργημένου ανθρώπου
κύτταρα και μπορεί να εκφραστεί σε ιστούς που προέρχονται από τον ασθενή

Κατεβάστηκε στο Πανεπιστήμιο Πατρών στις 19 Μαΐου 2021

0 \–alignSJstitchMismatchNmax -1–1 -1–1 \–chimSegmentMin 50
\–chimJunctionOverhangMin 50.
Για ανάλυση κλώνου RNA-seq, δημιουργήσαμε δεδομένα RNA-seq χρησιμοποιώντας RNA
από κύτταρα Calu3 μολυσμένα με SARS-CoV-2. Κατασκευάστηκαν λανθάνουσες βιβλιοθήκες
με το κιτ Kapa mRNA HyperPrep (Roche; 08098115702). Βιβλιοθήκες ήταν
Το qPCR έγινε χρησιμοποιώντας ένα κιτ quant βιβλιοθήκης KAPA qPCR σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.
Στη συνέχεια, οι βιβλιοθήκες συγκεντρώθηκαν σε ισομοριακές συγκεντρώσεις, για κάθε λωρίδα, με βάση

στις συγκεντρώσεις qPCR. Οι συγκεντρωμένες βιβλιοθήκες μετουσιώθηκαν χρησιμοποιώντας το Illu-
πρωτόκολλο mina. Οι μετουσιωμένες βιβλιοθήκες φορτώθηκαν σε ένα HiSeq 2500

(Illumina) και αναλύθηκε η αλληλουχία για 120 κύκλους από το ένα άκρο των θραυσμάτων.
Οι βασικές κλήσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το Illumina offline Basecaller (OLB) και στη συνέχεια
αποπολυπλεκτική. Πραγματοποιήσαμε λήψη δημοσιευμένων δεδομένων RNA-seq (κλωνωμένες βιβλιοθήκες)
από το GEO με τους αριθμούς πρόσβασης GSE147507 (50) (Calu3, SI Παράρτημα,
Πίνακας S1), GSE148697 (58) (οργανοειδή πνεύμονα, Παράρτημα SI, Πίνακας S1) και
GSE150316 (60) (ιστοί FFPE ασθενούς, Παράρτημα SI, Πίνακας S2). Ακατέργαστο RNA-seq
Οι αναγνώσεις ευθυγραμμίστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω, χρησιμοποιώντας τις παραμέτρους-chimSegmentMin
30 \–chimJunctionOverhangMin 30 για να καλέσετε τις χιμαιρικές αναγνώσεις. Βγάλαμε συνολικά
ιικές αναγνώσεις και χιμαιρικές αναγνώσεις ανθρώπου-ιικού όπως περιγράφεται παραπάνω. Μετατρέπουμε
το viral διάβαζε αρχεία BAM σε αρχεία Bed χρησιμοποιώντας το βοηθητικό πρόγραμμα bamToBed στο BEDTools
(73). Στη συνέχεια μετρήσαμε τους συνολικούς και τους λανθάνοντες αριθμούς ανάγνωσης στη μετατροπή
Αρχεία BED.
Τα δημοσιευμένα δεδομένα RNA-seq ενός κυττάρου λήφθηκαν από το GEO με το
αριθμός πρόσβασης GSE145926 (61) (δείγματα BALF ασθενών, Παράρτημα SI, Πίνακας S3).

Για μαζική ανάλυση, διπλότυπες αναγνώσεις με το ίδιο read1 (UMI) και read2 se-
quences σε ακατέργαστα αρχεία fastq αφαιρέθηκαν από το dedup_hash (https://github.com/

mvdbeek/dedup_hash). Στη συνέχεια, η ομάδα του read2 ευθυγραμμίστηκε όπως περιγράφεται παραπάνω,
χρησιμοποιώντας παραμέτρους –chimSegmentMin 30 \–chimJunctionOverhangMin 30 για κλήση

χιμαιρικά διαβάζει. Η αναγνωσιμότητα αναλύθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. Για μονό-
ανάλυση κυττάρων, δημιουργήσαμε ένα προσαρμοσμένο γονιδίωμα από το Cell Ranger (10× Genomics Cell

Ranger 3.0.2) (74) mkref, χρησιμοποιώντας ένα αρχείο fasta που περιέχει το ανθρώπινο γονιδίωμα

ακολουθία από την έκδοση 93 ENSEMBL (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-93/fasta/

homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz) concate-
που προέρχεται από την ακολουθία SARS-CoV-2, GenBank ID: MN988713.1 και ένα αρχείο gtf

που περιέχει ανθρώπινα και ιογενή σχόλια. Ανάγνωση χαρτογράφησης, αντιστοίχιση αναγνώσεων στο κελί

Οι γραμμωτοί κώδικες και η αφαίρεση των διπλότυπων PCR έγιναν με Cell Ranger (10× Ge-
nomics Cell Ranger 4.0.0) (74), χρησιμοποιώντας το προσαρμοσμένο γονιδίωμα που περιγράφεται παραπάνω.

Επεξεργαστήκαμε τις μετρήσεις χρησιμοποιώντας το Seurat (έκδοση 3.2.2) (75). Αφαιρέσαμε κύτταρα που
είχαν λιγότερα από 200 γονίδια ανιχνευμένα ή περισσότερο από το 20% των μετρήσεων μεταγραφής
από τα μιτοχόνδρια. Για κάθε κελί, μετρήσαμε τον αριθμό των αναγνωσμένων αντιστοίχισης
είτε στον θετικό είτε στον αρνητικό ιικό κλώνο.
Διαθεσιμότητα δεδομένων. Όλα τα δεδομένα που υποστηρίζουν τα ευρήματα αυτής της μελέτης είναι διαθέσιμα
μέσα στο άρθρο και υποστηρικτικές πληροφορίες. Όλα τα δεδομένα αλληλουχίας που δημιουργούνται
σε αυτή τη μελέτη έχουν κατατεθεί στο Αρχείο Ακολουθίας Ανάγνωσης, https://www.

ncbi.nlm.nih.gov/sra (αρ. πρόσβασης PRJNA721333). Όλα τα δημοσιευμένα δεδομένα ανα-
που λύθηκαν σε αυτή τη μελέτη αναφέρονται σε αυτό το άρθρο με τις μεθόδους προσχώρησης που παρέχονται στο

Υλικά και μέθοδοι.
ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ. Ευχαριστούμε τα μέλη στα εργαστήρια της RJ και
RAY και άλλους συναδέλφους από το Ινστιτούτο Whitehead και τη Μασαχουσέτη
Ινστιτούτο Τεχνολογίας (MIT) για χρήσιμες συζητήσεις και πόρους. Ευχαριστούμε
Ο Thomas Volkert και το προσωπικό από τον πυρήνα της γονιδιωματικής Whitehead και ο Stuart Levine
από το κέντρο MIT/Koch Institute BioMicro για υποστήριξη αλληλουχίας. Ευχαριστούμε

Lorenzo Bombardelli για κοινή χρήση πρωτοκόλλου και συμβουλές για ετικετοποίηση Tn5-
διαμεσολαβούμενη αλληλουχία εμπλουτισμού ολοκλήρωσης. Ευχαριστούμε τον Jerold Chun, Inder

Verma, Joseph Ecker και Daniel W. Bellott για συζήτηση και προτάσεις. Αυτό
Η εργασία υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το NIH στην RJ (1U19AI131135-01;
5R01MH104610-21) και με ένα γενναιόδωρο δώρο από την Dewpoint Therapeutics και
από τον Jim Stone. Η SHH υποστηρίχθηκε από το Ενδοσχολικό Ερευνητικό Πρόγραμμα της
Κέντρο Έρευνας Καρκίνου του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου. Τέλος ευχαριστούμε
Νησί Nathans για έμπνευση.

1. Οργανισμός Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων της Κορέας, Ευρήματα από έρευνα και ανάλυση του
επανειλημμένες θετικές περιπτώσεις. https://www.kdca.go.kr/board/board.es?mid=a30402000000&bid=0030.
Πρόσβαση στις 12 Ιουνίου 2020.
2. J. Bullard et al., Πρόβλεψη λοιμώδους σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου κορωνοϊός 2
από διαγνωστικά δείγματα. Clin. Μολύνω. Dis. 71, 2663–2666 (2020).
3. X. He et al., Temporal dynamics in viral shedding and transmissibility of COVID-19.
Νύχτα. Με. 26, 672–675 (2020).
4. N. Li, X. Wang, T. Lv, Παρατεταμένη αποβολή RNA SARS-CoV-2: Δεν είναι σπάνιο φαινόμενο.
J. Med. Virol. 92, 2286–2287 (2020).

5. MJ Mina, R. Parker, DB Larremore, Rethinking COVID-19 test sensitivity — a strat-
α για περιορισμό. N. Engl. J. Med. 383, e120 (2020).

6. N. Sethuraman, SS Jeremiah, A. Ryo, Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2.
JAMA 323, 2249–2251 (2020).
7. J.-R. Yang et al., Επίμονη θετικότητα ιού RNA κατά την περίοδο ανάρρωσης ενός ασθενούς
με λοίμωξη SARS-CoV-2. J. Med. Virol. 92, 1681–1683 (2020).
8. J. An et al., Κλινικά χαρακτηριστικά των αναρρωμένων ασθενών με COVID-19 με ανιχνεύσιμα
θετικό τεστ RNA. Αννα. Μετάφρ. Med. 8, 1084 (2020).
9. D. Chen et al., Recurrence of positive SARS-CoV-2 RNA in COVID-19: A case report. Int.
J. Infect. Dis. 93, 297–299 (2020).
10. L. Lan et al., Θετικά αποτελέσματα δοκιμών RT-PCR σε ασθενείς που ανάρρωσαν από COVID-19. ΤΖΑΜΑ
323, 1502–1503 (2020).
11. D. Loconsole et al., Recurrence of COVID-19 after recovery: A case report from Italy.
Infection 48, 965–967 (2020).

12. J. Lu et al., Clinical, immunological and virological characterization of COVID-19 pa-
ασθενείς που δοκιμάζονται ξανά θετικοί για SARS-CoV-2 με RT-PCR. EBioMedicine 59, 102960 (2020).

13. S. Luo, Y. Guo, X. Zhang, H. Xu, Μια μελέτη παρακολούθησης των αναρρωμένων ασθενών με COVID-
19 στη Γουχάν της Κίνας. Int. J. Infect. Dis. 99, 408–409 (2020).

14. G. Ye et al., Κλινικά χαρακτηριστικά του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου κορωνοϊός 2
επανενεργοποίηση. J. Infect. 80, e14–e17 (2020).
15. R. Wölfel et al., Ιολογική αξιολόγηση νοσηλευόμενων ασθενών με COVID-2019.
Nature 581, 465–469 (2020).
16. M. Cevik et al., SARS-CoV-2, SARS-CoV, and MERS-CoV δυναμική ιικού φορτίου, διάρκεια
της αποβολής του ιού και της μολυσματικότητας: Μια συστηματική ανασκόπηση και μετα-ανάλυση. Νυστέρι
Microbe 2, e13–e22 (2021).
17. AL Rasmussen, SV Popescu, μετάδοση SARS-CoV-2 χωρίς συμπτώματα. Επιστήμη
371, 1206–1207 (2021).
18. KK To et al., COVID-19 επαναμόλυνση από φυλογενετικά διακριτό SARS-coronavirus-2
στέλεχος επιβεβαιωμένο με αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος. Clin. Μολύνω. Dis., 10.1093/cid/ciaa1275
(2020).
19. J. Huang et al., Recurrence of SARS-CoV-2 PCR positivity in COVID-19 ασθενείς: A
εμπειρία και πιθανές επιπτώσεις. medRxiv [Προεκτύπωση] (2020). https://
doi.org/10.1101/2020.05.06.20089573 (Πρόσβαση στις 6 Ιουνίου 2020).
20. B. Yuan et al., Recurrence of positive SARS-CoV-2 viral RNA in recoded COVID-19
ασθενείς κατά την παρακολούθηση της ιατρικής απομόνωσης. Sci. Rep. 10, 11887 (2020).

21. P. V’Kovski, A. Kratzel, S. Steiner, H. Stalder, V. Thiel, Coronavirus biology and rep-
Λήξη: Επιπτώσεις για τον SARS-CoV-2. Nat. Rev. Microbiol. 19, 155–170 (2021).

22. L. Alanagreh, F. Alzoughool, M. Atoum, The human coronavirus disease COVID-19: Its

προέλευση, χαρακτηριστικά και γνώσεις για πιθανά φάρμακα και τους μηχανισμούς τους. Παθο-
Άτομα 9, 331 (2020).

23. E. de Wit, N. van Doremalen, D. Falzarano, VJ Munster, SARS και MERS: Πρόσφατα
πληροφορίες για τους αναδυόμενους κοροναϊούς. Nat. Rev. Microbiol. 14, 523–534 (2016).

24. AR Fehr, S. Perlman, Coronaviruses: An overview of their replication and patho-
γένεση. Μέθοδοι ΜοΙ. Biol. 1282, 1–23 (2015).

25. VA Belyi, AJ Levine, AM Skalka, Απροσδόκητη κληρονομιά: Πολλαπλές ενσωματώσεις
των αρχαίων αλληλουχιών ιού βορναϊού και ιού Έμπολα/ ιού μαρβούργου σε γονιδιώματα σπονδυλωτών.
PLoS Pathog. 6, e1001030 (2010).

26. M. Horie et al., Endogenous non-retroviral RNA virus elements in mammalian ge-.
ονόματα. Nature 463, 84-87 (2010).

27. M. Horie, K. Tomonaga, Non-retroviral fossils in vertebrate genomes. Ιοί 3,
1836–1848 (2011).

28. A. Shimizu et al., Characterization of cytoplasmic DNA complementary to non-
ρετροϊκοί ιοί RNA σε ανθρώπινα κύτταρα. Sci. Rep. 4, 5074 (2014).

29. MB Geuking et al., Recombination of retrotransposon and exogenous RNA virus
έχει ως αποτέλεσμα την ενσωμάτωση μη ρετροϊικού cDNA. Science 323, 393–396 (2009).
30. P. Klenerman, H. Hengartner, RM Zinkernagel, A non-retroviral RNA virus persist in
Μορφή DNA. Nature 390, 298–301 (1997).
31. MH Lee et al., Somatic APP gene recombination in Alzheimer’s disease and normal
νευρώνες. Nature 563, 639–645 (2018).
32. CR Huang, KH Burns, JD Boeke, Active transposition in genomes. Annu. Στροφή μηχανής.
Genet. 46, 651–675 (2012).
33. HH Kazazian Jr, JV Moran, Mobile DNA στην υγεία και την ασθένεια. N. Engl. J. Med. 377,
361–370 (2017).
34. JM Coffin, Η. Fan, The discovery of reverse transcriptase. Annu. Rev. Virol. 3, 29–51
(2016).

35. M. De Cecco et al., L1 οδηγεί την IFN σε γηρασμένα κύτταρα και προάγει τη σχετιζόμενη με την ηλικία
φλεγμονή. Nature 566, 73–78 (2019).

36. B. Rodriguez-Martin et al.; Ομάδα εργασίας PCAWG Structural Variation; PCAWG
Κοινοπραξία, Παν-καρκινική ανάλυση ολόκληρων γονιδιωμάτων προσδιορίζει ανακατατάξεις οδηγών
προωθείται από την ρετρομεταφορά LINE-1. Nat. Genet. 52, 306–319 (2020).
37. EC Scott et al., Ένα καυτό ρετροτρανσποζόνιο L1 αποφεύγει τη σωματική καταστολή και ξεκινά
ανθρώπινος καρκίνος του παχέος εντέρου. Genome Res. 26, 745–755 (2016).

38. RB Jones et al., LINE-1 ρετρομεταβιβάσιμο στοιχείο DNA συσσωρεύεται στον HIV-1-in-
προσβεβλημένα κύτταρα. J. Virol. 87, 13307–13320 (2013).

39. MG Macchietto, RA Langlois, SS Shen, μεταθετικό στοιχείο που προκαλείται από ιούς ex-
ρύθμιση της πίεσης σε κύτταρα-ξενιστές ανθρώπου και ποντικού. Life Sci. Συμμαχία 3,

e201900536 (2020).
40. Y. Yin, XZ Liu, X. He, LQ Zhou, Εξωγενής κορωνοϊός αλληλεπιδρά με ενδογενή
ρετροτρανσποζόνη σε ανθρώπινα κύτταρα. Εμπρός. Κύτταρο. Μολύνω. Microbiol. 11, 609160 (2021).
41. H. Kaessmann, N. Vinckenbosch, M. Long, RNA-based gene duplication: Mechanistic
και εξελικτικές γνώσεις. Nat. Αιδ. Genet. 10, 19–31 (2009).

42. S. Lanciano, G. Cristofari, Measuring and interpreting transposable element expres-
Σιών. Nat. Αιδ. Genet. 21, 721–736 (2020).

43. TA Morrish et al., επιδιόρθωση DNA που διαμεσολαβείται από ανεξάρτητη από ενδονουκλεάση LINE-1 ret-
ρομεταφορά. Nat. Genet. 31, 159–165 (2002).

44. JC Venter et al., The sequence of the human genome. Science 291, 1304–1351
(2001).

Οι Zhang et al. PNAS | 9 στα 10
Το αντίστροφο μεταγραφόμενο RNA SARS-CoV-2 μπορεί να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του καλλιεργημένου ανθρώπου
κύτταρα και μπορεί να εκφραστεί σε ιστούς που προέρχονται από τον ασθενή

https://doi.org/10.1073/pnas.2105968118
ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ

Κατεβάστηκε στο Πανεπιστήμιο Πατρών στις 19 Μαΐου 2021

45. T. Sultana et al., The landscape of L1 retrotransposons in the human genome is
διαμορφώνεται από προκαταλήψεις ακολουθίας προ-εισαγωγής και επιλογή μετά την εισαγωγή. ΜοΙ. Κύτταρο 74,
555–570.e7 (2019).

46. ​​DA Flasch et al., Genome-wide de novo L1 retrotransposition connects endonu-
εκκαθάριση δραστηριότητας με αντιγραφή. Cell 177, 837–851.e28 (2019).

47. DL Stern, χαρτογράφηση με βάση ετικέτες (TagMap) του κινητού DNA γονιδιωματικού ενθέτου-
ιστοσελίδες. bioRxiv [Preprint] (2017). https://doi.org/10.1101/037762 (Πρόσβαση στις 16 Φεβρουαρίου-
ρουάριο 2021).

48. S. Picelli et al., Tn5 transposase and tagmentation procedures for massive scaled
έργα αλληλουχίας. Genome Res. 24, 2033–2040 (2014).
49. L. Zhang et al., SARS-CoV-2 RNA αντίστροφη μεταγραφή και ενσωμάτωση στον άνθρωπο

γονιδίωμα. bioRxiv [Preprint] (2020). https://doi.org/10.1101/2020.12.12.422516 (Ac-
λήγει στις 16 Μαρτίου 2021).

50. D. Blanco-Melo et al., Imbalanced host response to SARS-CoV-2 drives development of
COVID 19. Cell 181, 1036–1045.e9 (2020).
51. J. Huang et al., SARS-CoV-2 μόλυνση του πολυδύναμου ανθρώπινου πνεύμονα που προέρχεται από βλαστοκύτταρα
κυψελιδικά κύτταρα τύπου 2 προκαλούν μια ταχεία επιθηλιακή-εγγενή φλεγμονώδη απόκριση. Κυτταρικό στέλεχος
Cell 27, 962–973.e7 (2020).
52. JA Perez-Bermejo et al., μόλυνση από SARS-CoV-2 ανθρώπινων καρδιακών κυττάρων που προέρχονται από iPSC
αντανακλά κυτταροπαθητικά χαρακτηριστικά στις καρδιές ασθενών με COVID-19. Sci. Μετάφρ. Ιατρ.,
10.1126/scitranslmed.abf7872 (2021).
53. F. Jacob et al., Νευρικά κύτταρα και εγκεφαλικά οργανοειδή που προέρχονται από ανθρώπινα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα
αποκαλύπτουν ότι ο νευροτροπισμός του SARS-CoV-2 κυριαρχεί στο επιθήλιο του χοριοειδούς πλέγματος. Κύτταρο
Stem Cell 27, 937–950.e9 (2020).
54. GG Giobbe et al., SARS-CoV-2 μόλυνση και αναπαραγωγή σε ανθρώπινο έμβρυο και παιδιατρικό
γαστρικά οργανοειδή. bioRxiv [Preprint] (2020). https://doi.org/10.1101/2020.06.24.167049
(Πρόσβαση στις 28 Οκτωβρίου 2020).
55. SE Gill et al., Μεταγραφικό προφίλ λευκοκυττάρων σε κρίσιμους ασθενείς με COVID19:
Επιπτώσεις για την απόκριση και την πήξη της ιντερφερόνης. Intensive Care Med. Exp. 8, 75
(2020).
56. D. Kim et al., Thearchitecture of SARS-CoV-2 transcriptome. Cell 181, 914–921.e10
(2020).
57. B. Yan et al., Τα χιμαιρικά συμβάντα ιού ξενιστή σε κύτταρα μολυσμένα με SARS-CoV2 είναι σπάνια
και τεχνητό. bioRxiv [Preprint] (2021). https://doi.org/10.1101/2021.02.17.431704
(Πρόσβαση στις 20 Φεβρουαρίου 2021).
58. Y. Han et al., Identification of kandidate therapeutics COVID-19 using hPSC-derives
πνευμονικά οργανοειδή. bioRxiv [Preprint] (2020). https://doi.org/10.1101/2020.05.05.079095
(Πρόσβαση στις 10 Μαρτίου 2021).

59. S. Alexandersen, A. Chamings, TR Bhatta, SARS-CoV-2 γονιδιωματικό και υπογονιδιακό
Τα RNA στα διαγνωστικά δείγματα δεν αποτελούν δείκτη ενεργού αντιγραφής. Nat. Commun.
11, 6059 (2020).
60. N. Desai et al., Timeoral and spatial heterogeneity of host response to SARS-CoV-2
πνευμονική λοίμωξη. Nat. Commun. 11, 6319 (2020).
61. M. Liao et al., Single-cell landscape of bronchoalveolar immune κύτταρα σε ασθενείς με
COVID 19. Νύχτα. Με. 26, 842–844 (2020).
62. MC Dalakas, σύνδρομο Guillain-Barré: Η πρώτη τεκμηριωμένη ενεργοποίηση του COVID-19
αυτοάνοση νευρολογική νόσος: Ακολουθούν περισσότερα με τη μυοσίτιδα στο μέλλον. Neurol.
Neuroimmunol. Νευροφλεγμονή. 7, e781 (2020).

63. S. Pfeuffer et al., Autoimmunity complicating SARS-CoV-2 μόλυνση in Selective IgA-
έλλειψη. Neurol. Neuroimmunol. Νευροφλεγμονή. 7, e881 (2020).

64. A. Baum et al., Τα αντισώματα REGN-COV2 προλαμβάνουν και θεραπεύουν τη μόλυνση από SARS-CoV-2 σε
ρέζους μακάκους και χάμστερ. Science 370, 1110–1115 (2020).
65. BJ Wagstaff, M. Barnerssoi, AM Roy-Engel, Evolutionary conservation of the
λειτουργική σπονδυλωτότητα των στοιχείων LINE-1 πρωτευόντων και ποντικού. PLoS One 6, e19672
(2011).
[ PubMed ] 66. Farkash EA, Kao GD, Horman SR, Prak ET, Αυξήσεις ακτινοβολίας γάμμα
εξαρτώμενη από ενδονουκλεάση L1 ρετρομετάθεση σε προσδιορισμό καλλιεργημένων κυττάρων. Νουκλεϊκά οξέα
Res. 34, 1196–1204 (2006).
67. ΠΟΥ, Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (ΠΟΥ) πόρος εσωτερικής ανάπτυξης μοριακών
αναλύσεις. https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/whoinhouseassays.pdf;
sfvrsn=de3a76aa_2. Πρόσβαση στις 6 Ιουνίου 2020.
68. H. Li, Minimap2: Pairwise alignment for nucleotide sequences. Βιοπληροφορική 34,
3094–3100 (2018).
69. WJ Kent, BLAT–το εργαλείο ευθυγράμμισης που μοιάζει με BLAST. Genome Res. 12, 656–664 (2002).
70. A. Dobin et al., STAR: Ultrafast universal RNA-seq aligner. Βιοπληροφορική 29, 15–21
(2013).
71. Η. Li et al.; 1000 Genome Project Data Processing Subgroup, The sequence alignment/
μορφή χάρτη και SAMtools. Bioinformatics 25, 2078–2079 (2009).
72. F. Ramírez et al., deepTools2: Ένας διακομιστής web επόμενης γενιάς για δεδομένα σε βάθος αλληλουχίας
ανάλυση. Nucleic Acids Res. 44, W160–W165 (2016).
73. AR Quinlan, IM Hall, BEDTools: Μια ευέλικτη σουίτα βοηθητικών προγραμμάτων για σύγκριση γονιδιωματικών
χαρακτηριστικά. Bioinformatics 26, 841–842 (2010).
74. GX Zheng et al., Massively parallel digital transcriptional profiles of single cell.
Nat. Κοινή. 8, 14049 (2017).
75. T. Stuart et al., Comprehensive integration of single-cell data Cell 177,1888–1902.e21 (2019).