«ΤΟΤΕ ΕΙΔΑ ΤΟΝ ΟΥΡΑΝΟ ΑΝΟΙΧΤΟ, ΚΙ ΕΝΑ ΑΣΠΡΟ ΑΛΟΓΟ ΕΚΕΙ· Ο ΚΑΒΑΛΑΡΗΣ ΤΟΥ ΕΧΕΙ ΤΟ ΟΝΟΜΑ «ΠΙΣΤΟΣ ΚΑΙ ΑΛΗΘΙΝΟΣ», ΚΑΙ ΚΡΙΝΕΙ ΚΑΙ ΠΟΛΕΜΑΕΙ ΜΕ ΔΙΚΑΙΟΣΥΝΗ. ΤΑ ΜΑΤΙΑ ΤΟΥ ΗΤΑΝ ΣΑΝ ΠΥΡΙΝΗ ΦΛΟΓΑ ΚΑΙ ΣΤΟ ΚΕΦΑΛΙ ΤΟΥ ΕΙΧΕ ΣΤΕΜΜΑΤΑ ΠΟΛΛΑ ΚΙ ΟΝΟΜΑΤΑ ΓΡΑΜΜΕΝΑ, ΚΙ ΕΝΑ ΟΝΟΜΑ ΓΡΑΜΜΕΝΟ, ΠΟΥ ΚΑΝΕΝΑΣ ΔΕΝ ΤΟ ΞΕΡΕΙ ΠΑΡΑ ΜΟΝΑΧΑ ΑΥΤΟΣ. ΗΤΑΝ ΝΤΥΜΕΝΟΣ ΣΤΟΛΗ ΒΑΜΜΕΝΗ ΣΤΟ ΑΙΜΑ ΚΑΙ ΤΟ ΟΝΟΜΑ ΤΟΥ ΕΙΝΑΙ «Ο ΛΟΓΟΣ ΤΟΥ ΘΕΟΥ». ΤΟΝ ΑΚΟΛΟΥΘΟΥΣΑΝ ΤΑ ΟΥΡΑΝΙΑ ΣΤΡΑΤΕΥΜΑΤΑ ΚΑΒΑΛΑ ΣΕ ΑΣΠΡΑ ΑΛΟΓΑ, ΚΑΙ ΝΤΥΜΕΝΟΙ ΚΑΘΑΡΙΟ ΑΣΠΡΟ ΛΙΝΟ. ΕΝΑ ΔΙΚΟΠΟ ΚΟΦΤΕΡΟ ΣΠΑΘΙ ΕΒΓΑΙΝΕ ΑΠΟ ΤΟ ΣΤΟΜΑ ΤΟΥ, ΓΙΑ ΝΑ ΠΑΤΑΞΕΙ ΜΕ ΑΥΤΟ ΤΑ ΕΘΝΗ. ΑΥΤΟΣ ΘΑ ΤΟΥΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΙ ΜΕ ΣΙΔΕΡΕΝΙΟ ΡΑΒΔΙ. ΚΙ ΑΥΤΟΣ ΘΑ ΠΑΤΗΣΕΙ ΤΟ ΠΑΤΗΤΗΡΙ ΘΥΜΩΜΕΝΟΣ, ΓΙΑ ΝΑ ΤΡΕΞΕΙ ΣΑΝ ΚΡΑΣΙ Η ΟΡΓΗ ΤΟΥ ΘΕΟΥ ΤΟΥ ΠΑΝΤΟΚΡΑΤΟΡΑ. ΠΑΝΩ ΣΤΗ ΣΤΟΛΗ ΚΑΙ ΣΤΟ ΜΗΡΟ ΤΟΥ ΗΤΑΝ ΓΡΑΜΜΕΝΟ ΤΟ ΟΝΟΜΑ: «ΒΑΣΙΛΙΑΣ ΤΩΝ ΒΑΣΙΛΙΑΔΩΝ ΚΑΙ ΚΥΡΙΟΣ ΤΩΝ ΚΥΡΙΩΝ». «ΚΙ ΕΙΔΑ ΝΑ ΣΤΕΚΕΤΑΙ ΣΤΟΝ ΗΛΙΟ ΕΝΑΣ ΑΓΓΕΛΟΣ, ΠΟΥ ΕΚΡΑΞΕ ΜΕ ΔΥΝΑΤΗ ΦΩΝΗ ΣΕ ΟΛΑ ΤΑ ΟΡΝΙΑ ΤΑ ΠΕΤΟΥΜΕΝΑ ΜΕΣΟΥΡΑΝΙΣ: «ΕΜΠΡΟΣ, ΜΑΖΕΥΤΕΙΤΕ ΣΤΟ ΜΕΓΑΛΟ ΔΕΙΠΝΟ ΤΟΥ ΘΕΟΥ, ΓΙΑ ΝΑ ΦΑΤΕ ΣΑΡΚΕΣ ΒΑΣΙΛΙΑΔΩΝ ΚΑΙ ΣΑΡΚΕΣ ΣΤΡΑΤΗΓΩΝ, ΣΑΡΚΕΣ ΔΥΝΑΣΤΩΝ ΚΑΙ ΣΑΡΚΕΣ ΑΛΟΓΩΝ ΜΕ ΤΟΥΣ ΚΑΒΑΛΑΡΗΔΕΣ ΤΟΥΣ, ΤΙΣ ΣΑΡΚΕΣ ΟΛΩΝ, ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΚΑΙ ΔΟΥΛΩΝ, ΜΙΚΡΩΝ ΚΑΙ ΜΕΓΑΛΩΝ». «ΕΙΔΑ ΤΟΤΕ ΤΟ ΘΗΡΙΟ ΚΑΙ ΤΟΥΣ ΒΑΣΙΛΙΑΔΕΣ ΤΗΣ ΓΗΣ ΚΑΙ ΤΑ ΣΤΡΑΤΕΥΜΑΤΑ ΤΟΥΣ ΝΑ ΕΧΟΥΝ ΜΑΖΕΥΤΕΙ ΓΙΑ ΠΟΛΕΜΟ ΕΝΑΝΤΙΑ ΣΤΟΝ ΚΑΒΑΛΑΡΗ ΤΟΥ ΑΛΟΓΟΥ ΚΑΙ ΣΤΟ ΣΤΡΑΤΕΥΜΑ ΤΟΥ. ΚΑΙ ΠΙΑΣΤΗΚΕ ΤΟ ΘΗΡΙΟ ΚΑΙ Ο ΨΕΥΔΟΠΡΟΦΗΤΗΣ, ΠΟΥ ΗΤΑΝ ΜΑΖΙ ΤΟΥ ΚΑΙ ΠΟΥ ΜΕ ΕΝΤΟΛΗ ΤΟΥ ΕΚΑΝΕ ΤΙΣ ΤΕΡΑΤΟΥΡΓΙΕΣ ΜΕ ΑΥΤΕΣ ΕΙΧΕ ΠΛΑΝΕΨΕΙ ΕΚΕΙΝΟΥΣ ΠΟΥ ΔΕΧΤΗΚΑΝ ΤΟ ΧΑΡΑΓΜΑ ΤΟΥ ΘΗΡΙΟΥ ΚΙ ΕΚΕΙΝΟΥΣ ΠΟΥ ΠΡΟΣΚΥΝΗΣΑΝ ΤΟ ΑΓΑΛΜΑ ΤΟΥ. ΚΑΙ ΤΟΥΣ ΔΥΟ ΤΟΥΣ ΕΡΙΞΑΝ ΖΩΝΤΑΝΟΥΣ ΣΤΗ ΛΙΜΝΗ ΤΗΣ ΦΩΤΙΑΣ, ΠΟΥ ΕΚΑΙΓΕ ΜΕ ΘΕΙΑΦΙ». ΣΗΚΩΣΤΕ ΤΑ ΚΕΦΑΛΙΑ ΣΑΣ ΚΑΙ ΔΕΙΤΕ ΟΛΑ ΟΣΑ ΓΥΡΩ ΣΑΣ ΣΥΜΒΑΙΝΟΥΝ ΚΑΙ ΣΚΕΦΤΕΙΤΕ. ΣΚΕΦΤΕΙΤΕ ΣΟΒΑΡΑ, ΙΣΩΣ ΓΙΑ ΠΡΩΤΗ ΣΑΣ ΦΟΡΑ ΚΑΙ ΠΑΡΤΕ ΜΙΑ ΑΠΟΦΑΣΗ, ΕΣΤΩ ΕΤΟΥΤΗ ΤΗΝ ΥΣΤΑΤΗ ΣΤΙΓΜΗ. ΑΚΟΥΣΤΕ ΟΛΑ ΟΣΑ ΜΕΣΑ ΣΕ ΤΟΥΤΗ ΤΗΝ ΑΝΑΡΤΗΣΗ ΘΑ ΕΙΠΩΘΟΥΝ ΚΑΙ ΥΣΤΕΡΑ ΣΚΕΦΤΕΙΤΕ ΜΑ ΚΑΙ ΠΡΟΣΕΥΧΗΘΕΙΤΕ ΓΙΑΤΙ Η ΩΡΑ ΣΗΜΑΝΕ ΓΙΑ ΝΑ ΦΑΝΕΡΩΘΕΙ Ο ΑΙΩΝΙΟΣ ΒΑΣΙΛΙΑΣ ΣΤΗΝ ΕΝΔΟΞΗ ΜΕΓΑΛΟΠΡΕΠΕΙΑ ΤΟΥ. ΣΗΜΑΝΕ ΠΙΑ Η ΩΡΑ ΤΟΝ ΘΡΟΝΟ ΤΟΥ ΝΑ ΛΑΒΕΙ ΑΠΟ ΤΟΝ ΣΦΕΤΕΡΙΣΤΗ, ΑΠΟ ΤΟ ΦΙΔΙ ΤΟ ΑΡΧΑΙΟ, ΑΠΟ ΕΚΕΙΝΟΝ ΠΟΥ ΠΙΣΤΕΨΕ Ο ΑΝΟΗΤΟΣ ΟΤΙ ΕΙΝΑΙ Ο ΑΡΧΟΝΤΑΣ ΤΟΥ ΚΟΣΜΟΥ. ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΤΑ ΧΡΟΝΙΑ ΣΚΟΤΟΥΣ, ΑΠΟΣΤΑΣΙΑΣ, ΘΛΙΨΗΣ, ΧΡΟΝΙΑ ΠΟΥ ΣΤΗΝ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΤΟΥΣ, ΤΟΥ ΕΩΣΦΟΡΟΥ ΟΙ ΔΥΝΑΜΕΙΣ ΜΕ ΜΙΣΟΣ ΚΑΙ ΚΑΚΙΑ, ΜΕΝΟΣ ΚΑΙ ΒΛΑΣΦΗΜΙΑ ΒΑΣΑΝΙΣΑΝ ΤΟΥΣ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ ΠΟΥ ΒΡΕΘΗΚΑΝ ΣΤΟ ΔΡΟΜΟ ΤΟΥΣ. ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΘΕΛΗΣΑΝ ΤΟΝ ΛΥΤΡΩΤΗ ΤΟΥΣ ΝΑ ΠΙΣΤΕΨΟΥΝ ΑΛΛΑ ΚΙ ΟΣΟΥΣ ΤΟΝ ΠΙΣΤΕΨΑΝ ΚΑΙ ΓΙΑ ΕΚΕΙΝΟΝ ΕΔΩΣΑΝ ΩΣ ΜΑΡΤΥΡΕΣ ΤΗΝ ΖΩΗ ΤΟΥΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΔΙΚΗ ΤΟΥ ΔΟΞΑ ΚΑΙ ΤΗΝ ΑΓΑΠΗ ΤΟΥΣ ΓΙΑ ΕΚΕΙΝΟΝ. ΘΑ ΗΘΕΛΑ ΣΤΟ ΚΛΕΙΣΙΜΟ ΜΙΑΣ ΑΚΟΜΑ ΚΑΤΑΘΕΣΗΣ ΨΥΧΗΣ ΝΑ ΚΛΕΙΣΕΙΣ ΤΑ ΜΑΤΙΑ ΣΟΥ ΚΑΙ ΝΑ ΟΝΕΙΡΕΥΤΕΊΣ ΕΣΥ ΠΟΥ ΑΙΣΘΆΝΕΣΑΙ ΟΤΙ ΕΊΣΑΙ ΈΝΑ ΧΑΜΈΝΟ ΠΡΟΒΑΤΟ ΣΕ ΑΥΤΟ ΤΟΝ ΣΚΛΗΡΌ ΚΌΣΜΟ, ΣΕ ΕΝΑΝ ΚΟΣΜΟ ΠΟΛΕΜΟΥ, ΑΣΘΕΝΕΙΑΣ, ΠΕΙΝΑΣ, ΑΣΧΗΜΙΑΣ, ΑΔΙΕΞΟΔΩΝ, ΑΠΕΛΠΙΣΙΑΣ, ΕΛΛΕΙΨΗΣ ΑΓΑΠΗΣ, ΟΤΙ ΥΠΑΡΧΕΙ ΚΑΠΟΙΟΣ ΠΟΥ ΕΔΩΣΕ ΤΗΝ ΖΩΗ ΤΟΥ ΓΙΑ ΕΣΕΝΑ ΓΙΑ ΝΑ ΣΟΥ ΧΑΡΙΣΕΙ ΑΙΩΝΙΑ ΖΩΗ. ΕΚΕΙΝΟΣ ΠΟΥ ΑΠΟΨΕ ΚΑΘΩΣ Η ΝΥΧΤΑ ΑΠΛΩΝΕΙ ΤΟ ΠΕΠΛΟ ΤΗΣ ΒΑΡΥ, ΑΠΟΨΕ ΠΟΥ ΝΙΩΘΕΙΣ ΝΑ ΕΙΣΑΙ ΤΟΣΟ ΜΟΝΟΣ ΚΑΙ ΤΟΣΟ ΜΟΝΗ, ΑΠΟΨΕ ΠΟΥ ΕΝΑΣ ΦΟΒΟΣ ΓΛΙΣΤΡΑΕΙ ΜΕΣΑ ΣΤΗΝ ΚΑΡΔΙΑ ΣΟΥ, ΚΑΙ ΣΚΕΨΕΙΣ ΜΑΥΡΕΣ ΣΕ ΚΥΡΙΕΥΟΥΝ, ΝΑ ΘΥΜΑΣΑΙ ΟΤΙ ΥΠΑΡΧΕΙ ΚΑΠΟΙΟΣ ΠΟΥ ΣΟΥ ΑΠΛΩΝΕΙ ΤΟ ΧΕΡΙ ΝΑ ΣΕ ΑΓΓΙΞΕΙ, ΝΑ ΣΕ ΠΑΡΕΙ ΣΤΗΝ ΑΓΚΑΛΙΑ ΤΟΥ ΝΑ ΚΟΙΜΗΘΕΙΣ ΓΛΥΚΑ, ΝΑ ΣΕ ΚΡΑΤΗΣΕΙ ΜΕ ΤΟΥΣ ΑΙΩΝΙΟΥΣ ΒΡΑΧΙΟΝΕΣ ΤΟΥ ΓΕΡΑ, ΝΑ ΝΙΩΣΕΙΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑ ΚΑΙ ΣΙΓΟΥΡΙΑ ΣΕ ΕΝΑΝ ΚΟΣΜΟ ΠΟΥ ΔΙΑΡΚΩΣ ΧΑΝΕΤΑΙ. ΚΙ ΟΤΑΝ ΕΚΕΙΝΟΣ ΣΕ ΚΡΑΤΑ ΣΤΑ ΧΕΡΙΑ ΤΟΥ ΝΑ ΣΕ ΑΓΓΙΞΕΙ ΚΑΝΕΙΣ ΔΕΝ ΘΑ ΤΟΛΜΗΣΕΙ. ΑΠΟΨΕ, ΛΟΙΠΟΝ, ΚΟΙΜΗΣΟΥ ΓΛΥΚΑ ΚΑΙ ΜΗΝ ΛΗΣΜΟΝΗΣΕΙΣ ΝΑ ΠΡΟΣΕΥΧΗΘΕΙΣ ΓΙΑ ΟΛΕΣ ΕΚΕΙΝΕΣ ΤΙΣ ΨΥΧΕΣ ΠΟΥ ΧΑΝΟΝΤΑΙ ΕΞΑΙΤΙΑΣ ΕΝΟΣ ΠΟΛΕΜΟΥ ΠΟΥ ΜΑΙΝΕΤΑΙ ΤΟΣΟ ΚΟΝΤΑ ΣΟΥ ΚΑΙ ΣΤΕΛΝΕΙ ΣΤΟΝ ΘΑΝΑΤΟ ΑΝΘΡΩΠΩΝ ΑΘΩΕΣ ΨΥΧΕΣ.
*ΤΟ ΚΕΙΜΕΝΟ ΚΑΙ ΤΟ ΒΙΝΤΕΟ ΠΡΟΕΡΧΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟ ΚΑΝΑΛΙ ΣΤΟ YOUTUBE ΤΑ ΕΡΗΜΟΠΟΥΛΙΑ ΤΟΥ ΠΑΡΑΔΕΙΣΟΥ.
Ραγδαίες οι εξελίξεις στο θέμα “πανδημία” και παρά τα φαινομενικά “καλά” νέα, λυπάμαι αλλά δε θα συμμεριστώ την αισιοδοξία των πολλών. Ποια είναι τα “καλά” νέα; Μα η αναγγελία ουσιαστικά του τέλους της από τα πλέον επίσημα χείλη -αυτά του Μπιλάκου, αφού τα τσιράκια απλά παπαγαλίζουν ό,τι πει το αφεντικό- και η άρση των μέτρων -ακόμα και αυτού του πιστοποιητικού- σε αρκετές χώρες, πλην Αυστρίας, Γερμανίας, Αυστραλίας και Ψωροκώσταινας βεβαίως βεβαίως.
Και βέβαια, σε όλα αυτά, το χεράκι τους έβαλαν οι Καναδοί νταλικέρηδες, που μέσα σε κάτι μερούλες ξεσήκωσαν το σύμπαν και έκαναν τα Καμπαλάκια, να τρέχουν, να κρυφτούν στα λαγούμια τους! Και άκου να δεις τώρα! Τους ακολούθησαν όλες οι χώρες, αφού κυκλοφόρησε η παρακάτω αφίσα, που όλως τυχαίως έχει την ίδια γραμματοσειρά με αυτές του World Economic Forum!!!!! Ρε σεις, ψυχάρα ο Satan Klaus και τον είχα παρεξηγήσει. Ναι, ρε ούφο! Τι δεν καταλαβαίνετε; Τους δάνεισε μέχρι και το γραφίστα του, μην κάνουν προχειροδουλειές και τους σνομπάρει ο κοσμάκης. Sorry, μπαρμπα Schwab, να με συμπαθάς, δικέ μου! Παίρνω πίσω ό,τι κακία σου έχω ξαμολήσει και σου στέλνω ρεγάλο και ένα ζευγάρι ζαρντιέρες, από εκείνες τις ροζ, τις δικτυωτές, που σ’ αρέσουν… Θα το κάψετε κυρ Στέφανε… Αλλά ας έρθω στο θέμα μου, γιατί δυστυχώς τα πράγματα είναι σοβαρά και όσο και αν το παλεύω, τείνω να χάσω το χιούμορ μου με όλα όσα συμβαίνουν στην υφήλιο τα τελευταία δύο χρόνια. Και ειλικρινά, δεν έχω καμιά διάθεση κινδυνολογίας ούτε μου αρέσει, να τρομοκρατώ τον κόσμο αλλά δεν μπορώ, να είμαι αφελής και να θεωρώ, ότι ζούμε σε ένα γαλάζιο συννεφάκι και ότι θα ιδρώσει το αυτί των σ@τανιστών νεοταξιτών, επειδή οι λαοί ξεσηκώθηκαν και διεκδικούν τα δικαιώματά τους ή ότι δεν το είχαν ήδη προβλέψει και έπεσαν από τα σύννεφα.
Γιατί το έγραφα αυτό; Επειδή η Δρ Εύη Δουβάρα, που ψαχουλεύει τα επίσημα κιτάπια Ε.Ε. και λοιπών μας είχε αποκαλύψει το σχέδιο και τη βεβαιότητά τους, ότι: “Μέχρι το 2022 θα έχουμε υπερπηδήσει όλα τα νομικά εμπόδια για τον προγραμματισμένο διενεργούμενο εμβολιασμό όλων των ηλικιακών ομάδων και δε θα μπορεί κανείς να μας ξεφύγει.” Ουάου!!!
(στο 30′ του παρακάτω βίντεο)
Και πριν αλέκτορα φωνήσαι, μας αποκάλυψαν και τον τρόπο. ΄Οχι καλέ! Δεν το έβγαλαν φόρα παρτίδα στα τσοντοκάναλα! Το έκρυψαν! Πού αλλού; Μα εκεί που κρύβεται ο διάβολος: στις λεπτομέρειες! Πέφτει λοιπόν χθες στην αντίληψή μου το παρακάτω: https://www.consilium.europa.eu/en/policies/coronavirus/pandemic-treaty/
Το οποίο ούτε λίγο ούτε πολύ μας ενημερώνει, ότι “η Παγκόσμια Συνέλευση Υγείας ξεκινά διαπραγματεύσεις … μπλα μπλα μπλα… για μια διεθνή συνθήκη για την πρόληψη και την ετοιμότητα των μελλοντικών πανδημιών”.
Τέλεια! Και πού είναι το κακό σε αυτό;
Αμάν, ρε παίδες, στο διάβολο και στις λεπτομέρειες είπαμε…
΄Οπως μας ενημερώνει η Δρ Astrid Stuckelberger, που εργαζόταν για πολλά χρόνια στον Π.Ο.Υ. και γνωρίζει πράγματα εκ των έσω, ο στόχος αυτής της συνθήκης είναι, να παραδώσει εν λευκώ στον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας την εξουσία για τη διαχείριση των μελλοντικών πανδημιών (ή ακόμα και άλλων καταστάσεων, που έχουν, να κάνουν με την κλιματική αλλαγή).
Αυτό σε απλά Ελληνικά σημαίνει, ότι ο Π.Ο.Υ. θα αποφασίζει και θα διατάσσει όποτε γουστάρει τον υποχρεωτικό εμβολιασμό των πάντων γράφοντας στα παλαιότερα των υποδημάτων του συντάγματα χωρών, διεθνείς συμβάσεις και άλλα νομικά εμπόδια που υπάρχουν μέχρι στιγμής για την επιβολή ιατρικών πράξεων!!! Και όταν λέμε Π.Ο.Υ., όλοι γνωρίζουμε, ποιος είναι ο μεγαλύτερος χρηματοδότης του και ποιος λύνει και δένει και δίνει εντολές! Ναι, ο σχιζοφρενής δολοφόνος με τα emvolia, ο μεγιστάνας Βασιλάκης ο Πύλης, ο μέγας φιλάνθρωπος που με τη “φαρμακεία” του προσπαθεί, να πλανήσει πάντα τα έθνη! Και συνεχίζει η Δρ Stuckelberger, ότι με μια απλή υπογραφή του Υπουργού Υγείας μιας χώρας, οι πολίτες της θα είναι πλέον σιδηροδέσμιοι των όποιων αποφάσεων του διεφθαρμένου και διεστραμμένου Π.Ο.Υ.! Και αυτό πάλι σαν κάτι να μου θυμίζει, αφού κάποιος κάπου κάποτε (Υπουργός Οικονομικών Γιώργος Παπακωνσταντίνου / πρώτη δανειακή σύμβαση) έβαλε φαρδιά πλατιά την τζίφρα του και παρέδωσε “αμετάκλητα και άνευ όρων” την εθνική κυριαρχία της χώρας μας! ΄Ενας επόμενος πρ@δ@της (και έχουμε πολλούς τέτοιους) θα μπορεί, να παραδώσει αμετάκλητα και άνευ όρων τα ίδια τα κορμιά μας!!! Τι λες τώρα!
Και όπως μας πληροφορεί η Δρ Stuckelberger, επείγει, να στείλει κάθε χώρα δημόσια επιστολή διαμαρτυρίας προς τον Π.Ο.Υ. λέγοντας, ότι είναι απαράδεκτο η υπογραφή ενός Υπουργού Υγείας, να αποφασίζει για την τύχη εκατομμυρίων ανθρώπων χωρίς δημοψήφισμα. Και πόσες χώρες λέτε, να έχουν στείλει τέτοια επιστολή μέχρι στιγμής; Η εξής μία: η Ρωσία!
Οπότε, πώς ακριβώς το φαντάζομαι το πράγμα;
Το πείραμα της ΝΤΠ που ακούει στο όνομα Covid 19 και που επισήμως έχει ημερομηνία λήξης 31/3/2025 ίσως λήξει νωρίτερα, επειδή απλούστατα πέτυχε το στόχο του:
Ο κοσμάκης στην πλειοψηφία του κατάπιε αμάσητο το παραμύθι και υπάκουσε στις άκρως δικτατορικές εντολές για εγκλεισμούς, μάσκες, τεστ, emvolia είτε με τη θέλησή του είτε εκβιαζόμενος!
Η τακτική του διαίρει και βασίλευε είχε τέτοια επιτυχία, που θα τη ζήλευε ακόμα και αυτός ο πρώτος διδάξας Νικολό Μακιαβέλι!
Μπολιασμένοι και αμπόλιαστοι έσκυψαν -και πάλι στην πλειοψηφία τους- το κεφάλι και δέχτηκαν, να τους σκανάρουν -είτε το πιστοποιητικό εμβολιασμού είτε το νόσησης είτε ακόμα ακόμα το αρνητικό τεστ- προκειμένου, να εξυπηρετούνται σε δημόσιες ή ιδιωτικές επιχειρήσεις και “να κάνουν τη δουλειά τους”!
Λογικό είναι λοιπόν οι νεοταξίτες, να προβούν όχι σε άτακτη αλλά σε τακτική “υποχώρηση” και να ανασυνταχθούν τώρα που το χαλί είναι στρωμένο για την επιβολή της παγκόσμιας χούντας!
Υποθέτω και πάλι, ότι θα μπορούσαν, να επανέλθουν με μια επόμενη πανδημία, όχι μαϊμού αυτή τη φορά. Μα γιατί το λες αυτό; Εγώ το λέω, καλέ, ή ο Μπιλάκος μας, που πολύ ανησυχεί το καημένο μου, τόσο που δε θα φάει το βράδυ!
Θα μπορούσε, να είναι ο ιός Marburg, που προκαλεί μολυσματικό αιμορραγικό πυρετό παρόμοιο με τον Έμπολα και που ο Τέντρος, το καλό παιδί και το άξιο παληκάρι του Π.Ο.Υ. τον αποκάλεσε “επιδημιογενή”, πράγμα που σημαίνει ότι μπορεί να εξαπλωθεί εύκολα μεταξύ των ανθρώπων;
Θα μπορούσε να είναι ο ιός της ευλογιάς, που παρα-ακούγεται τελευταία;
΄Η μήπως θα μπορούσε, να είναι η ασθένεια της σαρκός, για την οποία έχει μιλήσει ο Μόρφου και υπάρχει και στις κάρτες Ιλλουμινάτι; Την ίδια άραγε εννοούσε και ο γέρων Εφραίμ Αριζόνας, όταν έλεγε, ότι θα έρθει αρρώστια, που θα σαπίζει το στόμα, τα χέρια και τον πρωκτό;
Εν πάση περιπτώσει, όποια και αν είναι η επόμενη στημένη πανδημία, ο κοσμάκης είναι πλέον εκπαιδευμένος, στο να τηρήσει τα όποια μέτρα, όσο παρανοϊκά και αν φαντάζουν, πόσο μάλλον, αν αυτή είναι πραγματικά φονική ή φρικιαστική!
΄Οχι μάσκα αλλά ολόκληρη προβοσκίδα θα φορέσει, όχι ρινικό αλλά πρωκτικό τεστ θα κάνει, όχι δυο τρεις δόσεις εμβολίου αλλά σαράντα τρεις θα δεχτεί, όσο για το σκανάρισμα και τον QR code, τι πιο φυσιολογικό από αυτό;
Γιατί, ας μην είμαστε συνωμοσιολόγοι! Μια χαρά αθώα είναι τα υγειονομικά διαβατήρια! ΄Η μήπως όχι;
Σύμφωνα με το παραπάνω βίντεο τα “υγειονομικά διαβατήρια/πιστοποιητικά” φέρνουν ένα δυστοπικό μέλλον για την ανθρωπότητα.
Αποτελούν το τελευταίο γρανάζι σε μια μηχανή που στήνεται εδώ και πολλά χρόνια και σημειώνει το τέλος της Ελευθερίας και της Δημοκρατίας. Λίγοι είναι σε θέση, να διακρίνουν τον κίνδυνο που πλησιάζει ή να κατανοήσουν πλήρως το Ρουβίκωνα, που ετοιμαζόμαστε, να διασχίσουμε και να περάσουμε στο δυστοπικό κόσμο της απέναντι πλευράς.
Η καθολική υιοθέτησή του διαβατηρίου εμβολιασμού θα σημάνει το τέλος στις σημερινές στοιχειώδεις ελευθερίες. Για ο,τιδήποτε θέλεις, να κάνεις, θα πρέπει, να ζητήσεις πρώτα την άδεια και να εμφανιστεί το απαραίτητο “πράσινο τικ”. ΄Ηδη εν μια νυκτί οι ελευθερίες μετατράπηκαν σε προνόμια. Αυτά πλέον θα είναι εντελώς προσωρινά και θα σου παραχωρούνται για την καλή συμπεριφορά και τη συμμόρφωση.
Ακόμα και ο σημερινός εμβολιασμένος θα πρέπει, να εμβολιάζεται όποτε τον καλούν, διαφορετικά τα προνόμιά του θα ανακαλούνται. Τα διαβατήρια εμβολιασμού είναι απλά ο Δούρειος ίππος, αφού θα συγχωνευθούν με την ψηφιακή ταυτότητα. Το σημερινό πράσινο ή κόκκινο τικ που σου επιτρέπει ή σου απαγορεύει τη συμμετοχή στην κοινωνική ζωή, αύριο θα μετατραπεί σε βαθμολογία. Θα παίρνεις θετικούς ή αρνητικούς βαθμούς ανάλογα με τη συμπεριφορά σου.
΄Εσπασες τον κανόνα της απόστασης των δύο μέτρων; Μήπως έκανες μια ανάρτηση στα social media, με την οποία άσκησες κριτική στην κυβέρνηση; ΄Η μήπως έστειλες κάποιο βίντεο, που αμφισβητεί το ισχύον αφήγημα στο φίλο σου; Για όλα αυτά και για πολλά άλλα θα σου αφαιρούνται βαθμοί και ταυτόχρονα “προνόμια”.
Και αν όλο αυτό φαντάζει σαν σκηνή από ταινία επιστημονικής φαντασίας, ας θυμηθούμε, ότι ένα τέτοιο σύστημα κοινωνικής πίστωσης είναι ήδη πραγματικότητα στην Κίνα. Και ας κατανοήσουμε,ότι ο Δούρειος ίππος διαβατήριο εμβολιασμού – ψηφιακή ταυτότητα θα φέρει το σύστημα κοινωνικής πίστωσης και αυτό την ολοκληρωτική επιτήρηση του ανθρώπου.
Ολοκληρωτισμός με το κλειδί στο χέρι: Ο όρος σημαίνει απλώς, ότι η υποδομή για την ολοκληρωτική επιτήρηση των ανθρώπων είναι ήδη έτοιμη, αυτό που λείπει, για να ενεργοποιηθεί, είναι το τελευταίο γρανάζι της μηχανής, που ακούει στο όνομα πιστοποιητικό εμβολιασμού. Και μετά δε θα υπάρχει πισωγύρισμα. Η απόλυτη δικτατορία θα έχει επιβληθεί…
…………………………………………………………………………………………….
Και σε ποιο σημείο αυτής της διαδρομής βρισκόμαστε τώρα;
Αν αυτές οι φάσεις ολοκληρωθούν μέσω της πανδημίας Covid ή κάποιας άλλης, ποσώς ενδιαφέρει τους αλήτες. Και προσωπικά για ένα πράγμα είμαι σίγουρη: ΄
Ότι δεν πρόκειται, να κάνουν πίσω, αν δεν ανατρέψει κάποιος πολύ μεγάλος τα σχέδιά τους! Και δε μιλάω για Τραμπ, Πούτιν και κουραφέξαλα αλλά για τον ΄Ενα και μοναδικό Μεγαλοδύναμο, που ευελπιστούμε, ότι θα βάλει το χέρι Του, για να μας σώσει από την απόλυτη δυστοπική χούντα! Το αξίζουμε όμως;
Δ.Γιαννακόπουλος: «Στέλνω ένα μεγάλο συγγνώμη στον Β.Πούτιν για αυτά που έκανε η Ελλάδα στη Ρωσία τα τελευταία 24ωρα»
Απολογείται για τις πράξεις του Κ.Μητσοτάκη – «Το Παγκόσμιο Οικονομικό Φόρουμ προκάλεσε τον πόλεμο»
Σε μια καθαρά γεωπολιτική του παρέμβαση ο Δημήτρης Γιαννακόπουλος, ιδιοκτήτης της φαρμακοβιομηχανίας ΒΙΑΝΕΞ και «ψυχή» της ΚΑΕ Παναθηναϊκός (αν και πλέον εκφράζει την μεγάλη πλειοψηφία όλων των Ελλήνων, ανεξάρτητα οπαδικής ταυτότητας) ζητεί «μια τεράστια συγγνώμη από τον Β.Πούτιν γι’αυτά που έχουμε κάνει ως χώρα τα τελευταία 24ωρα και θα του έλεγα ότι όταν τελειώσει με όλους αυτούς τους νεοταξίτες να μας δώσει τη δυνατότητα να βγούμε μαζί με τη Σερβία από το ΝΑΤΟ».
Αναφέρεται βέβαια στην αποστολή όπλων και πυρομαχικών από την κυβέρνηση Μητσοτάκη στο ουκρανικό καθεστώς (ρουκέτες των 122 χλστ. για τα ρουκετοβόλα, αντιαρματικών RPG-18 και ΑΚ-47 Καλάσνικοφ), τα οποία όλα βγήκαν από τις αποθήκες του Ελληνικού Στρατού και ειδικά σε ότι αφορά τις ρουκέτες από τις αποθήκες όπλων των νησιών).
Απευθύνει έκκληση στον Β.Πούτιν γιατί όπως αναφέρει, «ξέρει ότι ο πόλεμος αυτός αφορά άλλα πράγματα για όσους ξέρουν και ενημερώνονται».
«Θα του έλεγα μάλιστα ότι μόλις τελειώσει με όλους αυτούς τους νεοταξίτες, να μας δώσει την ευκαιρία μαζί με την Σερβία να βγούμε από το ΝΑΤΟ».
Αναφερόμενος στους ξένους ηγέτες Τριντό, Μακρόν κ.λ.π. λέει πως «δεν ασχολείται με αυτούς γιατί παίρνουν εντολές και τους έχουν κρατημένους από τα @ρχίδι@ και κάνουν ότι τους λένε».
«Το ζήτημα είναι ποιοι κρύβονται από πίσω τους, το Παγκόσμιο Οικονομικό Φόρουμ, αυτούς πολεμάει ο Πούτιν».
Αναφέρει ότι «κάθε ζωή είναι πολύτιμη είτε είναι Μουσουλμάνου, είτε Ουκρανού, είτε Εβραίου, είτε οποιουδήποτε είναι το ίδιο πολύτιμη αλλά ο Β.Πούτιν πολεμάει για την ελευθερία.
Ο λόγος που δεν τα βάζω με τον εκάστοτε πρωθυπουργό, είτε αυτός λέγεται Τριντό, είτε Μακρόν, είτε Ζελένσκι είναι γιατί όλοι αυτοί είναι πιόνια του συστήματος, εντολές ακολουθούν, μην πω κιόλας ότι τους έχουν κρατημένους από τα @ρχίδι@ και κάνουν ότι τους λένε.
Το θέμα είναι ποιοι είναι από πίσω τους στο Παγκόσμιο Οικονομικό Φόρουμ… Αυτούς πολεμάει ο Πούτιν, αυτούς προσπαθεί να ρίξει και να μας σώσει εμάς και όλη την ανθρωπότητα.
Προφανώς και δεν πρέπει να πεθαίνει κόσμος, ούτε Ουκρανός, ούτε Ρώσος, ούτε Έλληνας, ούτε Τούρκος… όλες οι ανθρώπινες ζωές έχουν την ίδια αξία
Μάθετε, διαβάστε γιατί γίνεται ο πόλεμος στην Ουκρανία, πριν βγαίνουμε όλοι με τις κιτρινομπλέ και τις κιτρινογαλάζιες σημαίες (σ.σ.: αναφέρεται στις γραφικότητες μερικών, λίγων, που εμφανίζονται σε «εκδηλώσεις συμπαράστασης των Ουκρανών» με την… ουκρανική σημαία).
Κι όσον αφορά το τι θα έκανα, θα έστελνα μια τεράστια συγγνώμη στον Πούτιν γι’αυτά που έχουμε κάνει ως χώρα τα τελευταία 24ωρα και θα του έλεγα ότι όταν τελειώσει με όλους αυτούς τους νεοταξίτες να μας δώσει τη δυνατότητα να βγούμε μαζί με τη Σερβία από το ΝΑΤΟ».
Β.Πούτιν: «Οι μελλοντικές γενιές θα γεννηθούν χωρίς τις αλυσίδες των Rothschild -Αυτό είναι το καλύτερο δώρο» στην ανθρωπότητα αν επιτευχθεί.
(Ανανέωση, αρχικό κείμενο 00:01) Η σύγκρουση στην Ουκρανία δεν είναι μόνο για την Ουκρανία βέβαια. Υπάρχουν βαθύτερα αίτια που η Ρωσία έφτασε να πραγματοποιήσει την συγκεκριμένη επέμβαση στη χώρα.
Ένα από αυτά τα είχε περιγράψει ο ίδιος ο Ρώσος πρόεδρος στην ομιλία του ανάληψης για τέταρτη φορά της προεδρίας της χώρας του το Μάιο του 2018.
Απευθυνόμενος στο ρωσικό κοινοβούλιο μετά την ορκωμοσία του, ο Βλαντιμίρ Πούτιν είπε ότι η «απόλυτη ανεξαρτησία» από το παγκόσμιο τραπεζικό καρτέλ και τους παγκόσμιους οργανισμούς παροχής χρημάτων Rothschild θα ήταν το «μεγαλύτερο δώρο» που θα μπορούσε να προσφέρει στις μελλοντικές γενιές.
«Παλιά συμπεριφερόμασταν αφελώς, αλλά τώρα βλέπουμε ότι οι κανόνες του ΠΟΕ [Παγκόσμιος Οργανισμός Εμπορίου] παραβιάζονται πολύ συχνά, οι περιορισμοί επιβάλλονται για πολιτικούς λόγους, τους οποίους ονομάζουν κυρώσεις. Επιπλέον, όλο και περισσότερα από αυτά επιβάλλονται για να εξασφαλιστούν τα αγαπημένα ανταγωνιστικά τους πλεονεκτήματα», είχε πει ο Β.Πούτιν.
Δήλωσε ότι οι ολοκαίνουργιοι «περιορισμοί», που παραβιάζουν τις αρχές του παγκόσμιου εμπορίου, κάνουν τον κόσμο να δει ότι το μονοπώλιο του δολαρίου των Ηνωμένων Πολιτειών απειλεί και άλλους τομείς.
Σύμφωνα με τον Ρώσο ηγέτη, η αποδολαριοποίηση πρέπει να προωθηθεί επί της αρχής, προκειμένου να προστατευθεί η κυριαρχία της χώρας.
Εσείς όμως που υπακούσατε και δώσατε πίστη τόσο εύκολα πως θα βοηθηθείτε όταν η θύελλα ξεσπάσει; Κανείς δεν αναλαμβάνει την ευθύνη. Και όσο αργότερα θα συμβεί η παρενέργεια θα σας πουν δεν οφείλεται στο τσίμπημα αλλά στην ατυχία σας.
Γ.Ε.
Εμβόλια: Στη δημοσιότητα 400.000 σελίδες που ήθελαν να κρύψουν Pfizer-FDA – Εκατοντάδες παρενέργειες και θάνατοι νεογνών
Στη δημοσιότητα δόθηκε χθες το πρώτο μέρος των 400.000 σελίδων για τα εμβόλια Covid-19 που η Pfizer και ο FDA ήθελα να κρατήσουν κρυφές μέχρι το 2076.
Να θυμίσουμε ότι όταν ζητήθηκε από τον FDA να δώσει στη δημοσιότητα τα στοιχεία πάνω στα οποία βασίστηκε για να εγκρίνει τα εμβόλια για τον κορωνοϊό είχε υποστηρίξει ότι χρειάζονται 55 χρόνια για να συλλέξει και να παραδώσει τα στοιχεία.
Κάτι που δεν είχε καμία λογική, αφού ο FDA ενέκρινε το εμβόλια σε χρόνο-ρεκόρ!
Τελικά το πρώτο μέρος των 400.000 σελίδων δόθηκε στη δημοσιότητα και αποκαλύπτονται απίστευτα πράγματα, όσον αφορά τις παρενέργειες.
Η έκθεση απαριθμεί εκατοντάδες παρενέργειες, ταξινομημένες μάλιστα ανά αλφαβητική σειρά, ενώ ανάμεσά τους υπάρχουν ακόμα και θάνατοι νεογνών!
Preclinical studies of COVID-19 mRNA vaccine BNT162b2, developed by Pfizer and BioNTech, showed reversible hepatic effects in animals that received the BNT162b2 injection. Furthermore, a recent study showed that SARS-CoV-2 RNA can be reverse-transcribed and integrated into the genome of human cells. In this study, we investigated the effect of BNT162b2 on the human liver cell line Huh7 in vitro. Huh7 cells were exposed to BNT162b2, and quantitative PCR was performed on RNA extracted from the cells. We detected high levels of BNT162b2 in Huh7 cells and changes in gene expression of long interspersed nuclear element-1 (LINE-1), which is an endogenous reverse transcriptase. Immunohistochemistry using antibody binding to LINE-1 open reading frame-1 RNA-binding protein (ORFp1) on Huh7 cells treated with BNT162b2 indicated increased nucleus distribution of LINE-1. PCR on genomic DNA of Huh7 cells exposed to BNT162b2 amplified the DNA sequence unique to BNT162b2. Our results indicate a fast up-take of BNT162b2 into human liver cell line Huh7, leading to changes in LINE-1 expression and distribution. We also show that BNT162b2 mRNA is reverse transcribed intracellularly into DNA in as fast as 6 h upon BNT162b2 exposure.
Coronavirus disease 2019 (COVID-19) caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) was announced by the World Health Organization (WHO) as a global pandemic on 11 March 2020, and it emerged as a devasting health crisis. As of February 2022, COVID-19 has led to over 430 million reported infection cases and 5.9 million deaths worldwide [1]. Effective and safe vaccines are urgently needed to reduce the morbidity and mortality rates associated with COVID-19.
Several vaccines for COVID-19 have been developed, with particular focus on mRNA vaccines (by Pfizer-BioNTech and Moderna), replication-defective recombinant adenoviral vector vaccines (by Janssen-Johnson and Johnson, Astra-Zeneca, Sputnik-V, and CanSino), and inactivated vaccines (by Sinopharm, Bharat Biotech and Sinovac). The mRNA vaccine has the advantages of being flexible and efficient in immunogen design and manufacturing, and currently, numerous vaccine candidates are in various stages of development and application. Specifically, COVID-19 mRNA vaccine BNT162b2 developed by Pfizer and BioNTech has been evaluated in successful clinical trials [2,3,4] and administered in national COVID-19 vaccination campaigns in different regions around the world [5,6,7,8].
BNT162b2 is a lipid nanoparticle (LNP)–encapsulated, nucleoside-modified RNA vaccine (modRNA) and encodes the full-length of SARS-CoV-2 spike (S) protein, modified by two proline mutations to ensure antigenically optimal pre-fusion conformation, which mimics the intact virus to elicit virus-neutralizing antibodies [3]. Consistent with randomized clinical trials, BNT162b2 showed high efficiency in a wide range of COVID-19-related outcomes in a real-world setting [5]. Nevertheless, many challenges remain, including monitoring for long-term safety and efficacy of the vaccine. This warrants further evaluation and investigations. The safety profile of BNT162b2 is currently only available from short-term clinical studies. Less common adverse effects of BNT162b2 have been reported, including pericarditis, arrhythmia, deep-vein thrombosis, pulmonary embolism, myocardial infarction, intracranial hemorrhage, and thrombocytopenia [4,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20]. There are also studies that report adverse effects observed in other types of vaccines [21,22,23,24]. To better understand mechanisms underlying vaccine-related adverse effects, clinical investigations as well as cellular and molecular analyses are needed.
A recent study showed that SARS-CoV-2 RNAs can be reverse-transcribed and integrated into the genome of human cells [25]. This gives rise to the question of if this may also occur with BNT162b2, which encodes partial SARS-CoV-2 RNA. In pharmacokinetics data provided by Pfizer to European Medicines Agency (EMA), BNT162b2 biodistribution was studied in mice and rats by intra-muscular injection with radiolabeled LNP and luciferase modRNA. Radioactivity was detected in most tissues from the first time point (0.25 h), and results showed that the injection site and the liver were the major sites of distribution, with maximum concentrations observed at 8–48 h post-dose [26]. Furthermore, in animals that received the BNT162b2 injection, reversible hepatic effects were observed, including enlarged liver, vacuolation, increased gamma glutamyl transferase (γGT) levels, and increased levels of aspartate transaminase (AST) and alkaline phosphatase (ALP) [26]. Transient hepatic effects induced by LNP delivery systems have been reported previously [27,28,29,30], nevertheless, it has also been shown that the empty LNP without modRNA alone does not introduce any significant liver injury [27]. Therefore, in this study, we aim to examine the effect of BNT162b2 on a human liver cell line in vitro and investigate if BNT162b2 can be reverse transcribed into DNA through endogenous mechanisms.
2. Materials and Methods
2.1. Cell Culture
Huh7 cells (JCRB Cell Bank, Osaka, Japan) were cultured in 37 °C at 5% CO2 with DMEM medium (HyClone, HYCLSH30243.01) supplemented with 10% (v/v) fetal bovine serum (Sigma-Aldrich, F7524-500ML, Burlington, MA, USA) and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin (HyClone, SV30010, Logan, UT, USA). For BNT162b2 treatment, Huh7 cells were seeded with a density of 200,000 cells/well in 24-well plates. BNT162b2 mRNA vaccine (Pfizer BioNTech, New York, NY, USA) was diluted with sterile 0.9% sodium chloride injection, USP into a final concentration of 100 μg/mL as described in the manufacturer’s guideline [31]. BNT162b2 suspension was then added in cell culture media to reach final concentrations of 0.5, 1.0, or 2.0 μg/mL. Huh7 cells were incubated with or without BNT162b2 for 6, 24, and 48 h. Cells were washed thoroughly with PBS and harvested by trypsinization and stored in −80 °C until further use.
2.2. REAL-TIME RT-QPCR
RNA from the cells was extracted with RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, 74134, Hilden, Germany) following the manufacturer’s protocol. RT-PCR was performed using RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit (Thermo Fisher Scientific, K1622, Waltham, MA, USA) following the manufacturers protocol. Real-time qPCR was performed using Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, K0222, Waltham, MA, USA) with primers for BNT162b2, LINE-1 and housekeeping genes ACTB and GAPDH (Table 1).
Table 1. Primer sequences of RT-qPCR and PCR.
2.3. Immunofluorescence Staining and Confocal Imaging
Huh7 cells were cultured in eight-chamber slides (LAB-TEK, 154534, Santa Cruz, CA, USA) with a density of 40,000 cells/well, with or without BNT162b2 (0.5, 1 or 2 µg/mL) for 6 h. Immunohistochemistry was performed using primary antibody anti-LINE-1 ORF1p mouse monoclonal antibody (Merck, 3574308, Kenilworth, NJ, USA), secondary antibody Cy3 Donkey anti-mouse (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA), and Hoechst (Life technologies, 34850, Carlsbad, CA, USA), following the protocol from Thermo Fisher (Waltham, MA, USA). Two images per condition were taken using a Zeiss LSM 800 and a 63X oil immersion objective, and the staining intensity was quantified on the individual whole cell area and the nucleus area on 15 cells per image by ImageJ 1.53c. LINE-1 staining intensity for the cytosol was calculated by subtracting the intensity of the nucleus from that of the whole cell. All images of the cells were assigned a random number to prevent bias. To mark the nuclei (determined by the Hoechst staining) and the whole cells (determined by the borders of the LINE-1 fluorescence), the Freehand selection tool was used. These areas were then measured, and the mean intensity was used to compare the groups.
2.4. Genomic DNA Purification, PCR Amplification, Agarose Gel Purification, and Sanger Sequencing
Genomic DNA was extracted from cell pellets with PBND buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, 0.45% NP-40, 0.45% Tween-20) according to protocol described previously [32]. To remove residual RNA from the DNA preparation, RNase (100 µg/mL, Qiagen, Hilden, Germany) was added to the DNA preparation and incubated at 37 °C for 3 h, followed by 5 min at 95 °C. PCR was then performed using primers targeting BNT162b2 (sequences are shown in Table 1), with the following program: 5 min at 95 °C, 35 cycles of 95 °C for 30 s, 58 °C for 30 s, and 72 °C for 1 min; finally, 72 °C for 5 min and 12 °C for 5 min. PCR products were run on 1.4% (w/v) agarose gel. Bands corresponding to the amplicons of the expected size (444 bps) were cut out and DNA was extracted using QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, 28104, Hilden, Germany), following the manufacturer’s instructions. The sequence of the DNA amplicon was verified by Sanger sequencing (Eurofins Genomics, Ebersberg, Germany).
Statistics
Statistical comparisons were performed using two-tailed Student’s t-test and ANOVA. Data are expressed as the mean ± SEM or ± SD. Differences with p < 0.05 are considered significant.
2.5. Ethical Statements
The Huh7 cell line was obtained from Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB) Cell Bank.
3. Results
3.1. BNT162b2 Enters Human Liver Cell Line Huh7 Cells at High Efficiency
To determine if BNT162b2 enters human liver cells, we exposed human liver cell line Huh7 to BNT162b2. In a previous study on the uptake kinetics of LNP delivery in Huh7 cells, the maximum biological efficacy of LNP was observed between 4–7 h [33]. Therefore, in our study, Huh7 cells were cultured with or without increasing concentrations of BNT162b2 (0.5, 1.0 and 2.0 µg/mL) for 6, 24, and 48 h. RNA was extracted from cells and a real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR) was performed using primers targeting the BNT162b2 sequence, as illustrated in Figure 1. The full sequence of BNT162b2 is publicly available [34] and contains a two-nucleotides cap; 5′- untranslated region (UTR) that incorporates the 5′ -UTR of a human α-globin gene; the full-length of SARS-CoV-2 S protein with two proline mutations; 3′-UTR that incorporates the human mitochondrial 12S rRNA (mtRNR1) segment and human AES/TLE5 gene segment with two C→U mutations; poly(A) tail. Detailed analysis of the S protein sequence in BNT162b2 revealed 124 sequences that are 100% identical to human genomic sequences and three sequences with only one nucleotide (nt) mismatch in 19–26 nts (Table S1, see Supplementary Materials). To detect BNT162b2 RNA level, we designed primers with forward primer located in SARS-CoV-2 S protein regions and reverse primer in 3′-UTR, which allows detection of PCR amplicon unique to BNT162b2 without unspecific binding of the primers to human genomic regions.
Figure 1. PCR primer set used to detect mRNA level and reverse-transcription of BNT162b2. Illustration of BNT162b2 was adapted from previously described literature [34].
RT-qPCR results showed that Huh7 cells treated with BNT162b2 had high levels of BNT162b2 mRNA relative to housekeeping genes at 6, 24, and 48 h (Figure 2, presented in logged 2−ΔΔCT due to exceptionally high levels). The three BNT162b2 concentrations led to similar intracellular BNT162b2 mRNA levels at the different time points, except that the significant difference between 1.0 and 2.0 µg/mL was observed at 48 h. BNT162b2 mRNA levels were significantly decreased at 24 h compared to 6 h, but increased again at 48 h.
Figure 2. BNT162b2 mRNA levels in Huh7 cells treated with BNT162b2. Huh7 cells were treated without (Ctrl) or with 0.5 (V1), 1 (V2), and 2 µg/mL (V3) of BNT162b2 for 6 (green dots), 24 (orange dots), and 48 h (blue dots). RNA was purified and qPCR was performed using primers targeting BNT162b2. RNA levels of BNT162b2 are presented as logged 2−ΔΔCT values relative to house-keeping genes GAPDH and ACTB. Results are from five independent experiments (n = 5). Differences between respective groups were analyzed using two-tailed Student’s t-test. Data are expressed as the mean ± SEM. (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001 vs. respective control at each time point, or as indicated).
3.2. Effect of BNT162b2 on Human Endogenous Reverse Transcriptase Long Interspersed Nuclear Element-1 (LINE-1)
Here we examined the effect of BNT162b2 on LINE-1 gene expression. RT-qPCR was performed on RNA purified from Huh7 cells treated with BNT162b2 (0, 0.5, 1.0, and 2.0 µg/mL) for 6, 24, and 48 h, using primers targeting LINE-1. Significantly increased LINE-1 expression compared to control was observed at 6 h by 2.0 µg/mL BNT162b2, while lower BNT162b2 concentrations decreased LINE-1 expression at all time points (Figure 3).
Figure 3.LINE-1 mRNA levels in Huh7 cells treated with BNT162b2. Huh7 cells were treated without (Ctrl) or with 0.5 (V1), 1 (V2), and 2 µg/mL (V3) of BNT162b2 for 6 (green dots), 24 (red dots), and 48 h (blue dots). RNA was purified and qPCR was performed using primers targeting LINE-1. RNA levels of LINE-1 are presented as 2−ΔΔCT values relative to house-keeping genes GAPDH and ACTB. Results are from five independent experiments (n = 5). Differences between respective groups were analyzed using two-tailed Student’s t-test. Data are expressed as the mean ± SEM. (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001 vs. respective control at each time point, or as indicated; † p < 0.05 vs. 6 h-Ctrl).
Next, we studied the effect of BNT162b2 on LINE-1 protein level. The full-length LINE-1 consists of a 5′ untranslated region (UTR), two open reading frames (ORFs), ORF1 and ORF2, and a 3′UTR, of which ORF1 is an RNA binding protein with chaperone activity. The retrotransposition activity of LINE-1 has been demonstrated to involve ORF1 translocation to the nucleus [35]. Huh7 cells treated with or without BNT162b2 (0.5, 1.0 and 2.0 µg/mL) for 6 h were fixed and stained with antibodies binding to LINE-1 ORF1p, and DNA-specific probe Hoechst for visualization of cell nucleus (Figure 4a). Quantification of immunofluorescence staining intensity showed that BNT162b2 increased LINE-1 ORF1p protein levels in both the whole cell area and nucleus at all concentrations tested (Figure 4b–d).
Figure 4. Immunohistochemistry of Huh7 cells treated with BNT162b2 on LINE-1 protein distribution. Huh7 cells were treated without (Ctrl) or with 0.5, 1, and 2 µg/mL of BNT162b2 for 6 h. Cells were fixed and stained with antibodies binding to LINE-1 ORF1p (red) and DNA-specific probe Hoechst for visualization of cell nucleus (blue). (a) Representative images of LINE-1 expression in Huh7 cells treated with or without BNT162b2. (b–d) Quantification of LINE-1 protein in whole cell area (b), cytosol (c), and nucleus (d). All data were analyzed using One-Way ANOVA, and graphs were created using GraphPad Prism V 9.2. All data is presented as mean ± SD (** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001 as indicated).
3.3. Detection of Reverse Transcribed BNT162b2 DNA in Huh7 Cells
A previous study has shown that entry of LINE-1 protein into the nucleus is associated with retrotransposition [35]. In the immunofluorescence staining experiment described above, increased levels of LINE-1 in the nucleus were observed already at the lowest concentration of BNT162b2 (0.5 µg/mL). To examine if BNT162b2 is reversely transcribed into DNA when LINE-1 is elevated, we purified genomic DNA from Huh7 cells treated with 0.5 µg/mL of BNT162b2 for 6, 24, and 48 h. Purified DNA was treated with RNase to remove RNA and subjected to PCR using primers targeting BNT162b2, as illustrated in Figure 1. Amplified DNA fragments were then visualized by electrophoresis and gel-purified (Figure 5). BNT162b2 DNA amplicons were detected in all three time points (6, 24, and 48 h). Sanger sequencing confirmed that the DNA amplicons were identical to the BNT162b2 sequence flanked by the primers (Table 2). To ensure that the DNA amplicons were derived from DNA but not BNT162b2 RNA, we also performed PCR on RNA purified from Huh7 cells treated with 0.5 µg/mL BNT162b2 for 6 h, with or without RNase treatment (Ctrl 5 and 6 in Figure 5), and no amplicon was detected in the RNA samples subjected to PCR.
Figure 5. Detection of DNA amplicons of BNT162b2 in Huh7 cells treated with BNT162b2. Huh7 cells were treated without (Ctrl) or with 0.5 µg/mL of BNT162b2 for 6, 24, and 48 h. Genomic DNA was purified and digested with 100 µg/mL RNase. PCR was run on all samples with primers targeting BNT162b2, as shown in Figure 1 and Table 1. DNA amplicons (444 bps) were visualized on agarose gel. BNT: BNT162b2; L: DNA ladder; Ctrl1: cultured Huh7 cells; Ctrl2: Huh7 cells without BNT162b2 treatment collected at 6 h; Ctrl3: Huh7 cells without BNT162b2 treatment collected at 24 h; Ctrl4: Huh7 cells without BNT162b2 treatment collected at 48 h; Ctrl5: RNA from Huh7 cells treated with 0.5 µg/mL of BNT162b2 for 6 h; Ctrl6: RNA from Huh7 cells treated with 0.5 µg/mL of BNT162b2 for 6 h, digested with RNase.
Table 2. Sanger sequencing result of the BNT162b2 amplicon.
4. Discussion
In this study we present evidence that COVID-19 mRNA vaccine BNT162b2 is able to enter the human liver cell line Huh7 in vitro. BNT162b2 mRNA is reverse transcribed intracellularly into DNA as fast as 6 h after BNT162b2 exposure. A possible mechanism for reverse transcription is through endogenous reverse transcriptase LINE-1, and the nucleus protein distribution of LINE-1 is elevated by BNT162b2.
Intracellular accumulation of LNP in hepatocytes has been demonstrated in vivo [36]. A preclinical study on BNT162b2 showed that BNT162b2 enters the human cell line HEK293T cells and leads to robust expression of BNT162b2 antigen [37]. Therefore, in this study, we first investigated the entry of BNT162b2 in the human liver cell line Huh7 cells. The choice of BNT162b2 concentrations used in this study warrants explanation. BNT162b2 is administered as a series of two doses three weeks apart, and each dose contains 30 µg of BNT162b2 in a volume of 0.3 mL, which makes the local concentration at the injection site at the highest 100 µg/mL [31]. A previous study on mRNA vaccines against H10N8 and H7N9 influenza viruses using a similar LNP delivery system showed that the mRNA vaccine can distribute rather nonspecifically to several organs such as liver, spleen, heart, kidney, lung, and brain, and the concentration in the liver is roughly 100 times lower than that of the intra-muscular injection site [38]. In the assessment report on BNT162b2 provided to EMA by Pfizer, the pharmacokinetic distribution studies in rats demonstrated that a relatively large proportion (up to 18%) of the total dose distributes to the liver [26]. We therefore chose to use 0.5, 1, and 2 μg/mL of vaccine in our experiments on the liver cells. However, the effect of a broader range of lower and higher concentrations of BNT162b2 should also be verified in future studies.
In the current study, we employed a human liver cell line for in vitro investigation. It is worth investigating if the liver cells also present the vaccine-derived SARS-CoV-2 spike protein, which could potentially make the liver cells targets for previously primed spike protein reactive cytotoxic T cells. There has been case reports on individuals who developed autoimmune hepatitis [39] after BNT162b2 vaccination. To obtain better understanding of the potential effects of BNT162b2 on liver function, in vivo models are desired for future studies.
In the BNT162b2 toxicity report, no genotoxicity nor carcinogenicity studies have been provided [26]. Our study shows that BNT162b2 can be reverse transcribed to DNA in liver cell line Huh7, and this may give rise to the concern if BNT162b2-derived DNA may be integrated into the host genome and affect the integrity of genomic DNA, which may potentially mediate genotoxic side effects. At this stage, we do not know if DNA reverse transcribed from BNT162b2 is integrated into the cell genome. Further studies are needed to demonstrate the effect of BNT162b2 on genomic integrity, including whole genome sequencing of cells exposed to BNT162b2, as well as tissues from human subjects who received BNT162b2 vaccination.
Human autonomous retrotransposon LINE-1 is a cellular endogenous reverse transcriptase and the only remaining active transposon in humans, able to retrotranspose itself and other nonautonomous elements [40,41], and ~17% of the human genome are comprised of LINE-1 sequences [42]. The nonautonomous Alu elements, short, interspersed nucleotide elements (SINEs), variable-number-of-tandem-repeats (VNTR), as well as cellular mRNA-processed pseudogenes, are retrotransposed by the LINE-1 retrotransposition proteins working in trans [43,44]. A recent study showed that endogenous LINE-1 mediates reverse transcription and integration of SARS-CoV-2 sequences in the genomes of infected human cells [25]. Furthermore, expression of endogenous LINE-1 is often increased upon viral infection, including SARS-CoV-2 infection [45,46,47]. Previous studies showed that LINE-1 retrotransposition activity is regulated by RNA metabolism [48,49], DNA damage response [50], and autophagy [51]. Efficient retrotransposition of LINE-1 is often associated with cell cycle and nuclear envelope breakdown during mitosis [52,53], as well as exogenous retroviruses [54,55], which promotes entrance of LINE-1 into the nucleus. In our study, we observed increased LINE-1 ORF1p distribution as determined by immunohistochemistry in the nucleus by BNT162b2 at all concentrations tested (0.5, 1, and 2 μg/mL), while elevated LINE-1 gene expression was detected at the highest BNT162b2 concentration (2 μg/mL). It is worth noting that gene transcription is regulated by chromatin modifications, transcription factor regulation, and the rate of RNA degradation, while translational regulation of protein involves ribosome recruitment on the initiation codon, modulation of peptide elongation, termination of protein synthesis, or ribosome biogenesis. These two processes are controlled by different mechanisms, and therefore they may not always show the same change patterns in response to external challenges. The exact regulation of LINE-1 activity in response to BNT162b2 merits further study.
The cell model that we used in this study is a carcinoma cell line, with active DNA replication which differs from non-dividing somatic cells. It has also been shown that Huh7 cells display significant different gene and protein expression including upregulated proteins involved in RNA metabolism [56]. However, cell proliferation is also active in several human tissues such as the bone marrow or basal layers of epithelia as well as during embryogenesis, and it is therefore necessary to examine the effect of BNT162b2 on genomic integrity under such conditions. Furthermore, effective retrotransposition of LINE-1 has also been reported in non-dividing and terminally differentiated cells, such as human neurons [57,58].
The Pfizer EMA assessment report also showed that BNT162b2 distributes in the spleen (<1.1%), adrenal glands (<0.1%), as well as low and measurable radioactivity in the ovaries and testes (<0.1%) [26]. Furthermore, no data on placental transfer of BNT162b2 is available from Pfizer EMA assessment report. Our results showed that BNT162b2 mRNA readily enters Huh7 cells at a concentration (0.5 µg/mL) corresponding to 0.5% of the local injection site concentration, induce changes in LINE-1 gene and protein expression, and within 6 h, reverse transcription of BNT162b2 can be detected. It is therefore important to investigate further the effect of BNT162b2 on other cell types and tissues both in vitro and in vivo.
5. Conclusions
Our study is the first in vitro study on the effect of COVID-19 mRNA vaccine BNT162b2 on human liver cell line. We present evidence on fast entry of BNT162b2 into the cells and subsequent intracellular reverse transcription of BNT162b2 mRNA into DNA.
M.A., F.O.F., D.Y., M.B. and C.L. performed in vitro experiments. M.A. and F.O.F. performed data analysis. M.R. and Y.D.M. contributed to the implementation of the research, designed, and supervised the study. Y.D.M. wrote the paper with input from all authors. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript.
Funding
This study was supported by the Swedish Research Council, Strategic Research Area Exodiab, Dnr 2009-1039, the Swedish Government Fund for Clinical Research (ALF) and the foundation of Skåne University Hospital.
Institutional Review Board Statement
Not applicable.
Informed Consent Statement
Not applicable.
Data Availability Statement
All data supporting the findings of this study are available within the article and supporting information.
Acknowledgments
The authors thank Sven Haidl, Maria Josephson, Enming Zhang, Jia-Yi Li, Caroline Haikal, and Pradeep Bompada for their support to this study.
Conflicts of Interest
The authors declare no conflict of interest.
References
World Health Organization. Coronavirus (COVID-19) Dashboard. Available online: https://covid19.who.int/ (accessed on 22 February 2022).
Mulligan, M.J.; Lyke, K.E.; Kitchin, N.; Absalon, J.; Gurtman, A.; Lockhart, S.; Neuzil, K.; Raabe, V.; Bailey, R.; Swanson, K.A.; et al. Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults. Nature2020, 586, 589–593. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Walsh, E.E.; Frenck, R.W., Jr.; Falsey, A.R.; Kitchin, N.; Absalon, J.; Gurtman, A.; Lockhart, S.; Neuzil, K.; Mulligan, M.J.; Bailey, R.; et al. Safety and Immunogenicity of Two RNA-Based COVID-19 Vaccine Candidates. N. Engl. J. Med.2020, 383, 2439–2450. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Polack, F.P.; Thomas, S.J.; Kitchin, N.; Absalon, J.; Gurtman, A.; Lockhart, S.; Perez, J.L.; Perez Marc, G.; Moreira, E.D.; Zerbini, C.; et al. Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA COVID-19 Vaccine. N. Engl. J. Med.2020, 383, 2603–2615. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Harris, R.J.; Hall, J.A.; Zaidi, A.; Andrews, N.J.; Dunbar, J.K.; Dabrera, G. Effect of Vaccination on Household Transmission of SARS-CoV-2 in England. N. Engl. J. Med.2021, 385, 759–760. [Google Scholar] [CrossRef]
Butt, A.A.; Omer, S.B.; Yan, P.; Shaikh, O.S.; Mayr, F.B. SARS-CoV-2 Vaccine Effectiveness in a High-Risk National Population in a Real-World Setting. Ann. Intern. Med.2021, 174, 1404–1408. [Google Scholar] [CrossRef]
Dagan, N.; Barda, N.; Kepten, E.; Miron, O.; Perchik, S.; Katz, M.A.; Hernan, M.A.; Lipsitch, M.; Reis, B.; Balicer, R.D. BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine in a Nationwide Mass Vaccination Setting. N. Engl. J. Med.2021, 384, 1412–1423. [Google Scholar] [CrossRef]
Rossman, H.; Shilo, S.; Meir, T.; Gorfine, M.; Shalit, U.; Segal, E. COVID-19 dynamics after a national immunization program in Israel. Nat. Med.2021, 27, 1055–1061. [Google Scholar] [CrossRef]
Fan, B.E.; Shen, J.Y.; Lim, X.R.; Tu, T.M.; Chang, C.C.R.; Khin, H.S.W.; Koh, J.S.; Rao, J.P.; Lau, S.L.; Tan, G.B.; et al. Cerebral venous thrombosis post BNT162b2 mRNA SARS-CoV-2 vaccination: A black swan event. Am. J. Hematol.2021, 96, E357–E361. [Google Scholar] [CrossRef]
Menni, C.; Klaser, K.; May, A.; Polidori, L.; Capdevila, J.; Louca, P.; Sudre, C.H.; Nguyen, L.H.; Drew, D.A.; Merino, J.; et al. Vaccine side-effects and SARS-CoV-2 infection after vaccination in users of the COVID Symptom Study app in the UK: A prospective observational study. Lancet Infect. Dis.2021, 21, 939–949. [Google Scholar] [CrossRef]
Hansen, T.; Titze, U.; Kulamadayil-Heidenreich, N.S.A.; Glombitza, S.; Tebbe, J.J.; Rocken, C.; Schulz, B.; Weise, M.; Wilkens, L. First case of postmortem study in a patient vaccinated against SARS-CoV-2. Int. J. Infect. Dis.2021, 107, 172–175. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Kadali, R.A.K.; Janagama, R.; Peruru, S.; Malayala, S.V. Side effects of BNT162b2 mRNA COVID-19 vaccine: A randomized, cross-sectional study with detailed self-reported symptoms from healthcare workers. Int. J. Infect. Dis.2021, 106, 376–381. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Parkash, O.; Sharko, A.; Farooqi, A.; Ying, G.W.; Sura, P. Acute Pancreatitis: A Possible Side Effect of COVID-19 Vaccine. Cureus2021, 13, e14741. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Mazzatenta, C.; Piccolo, V.; Pace, G.; Romano, I.; Argenziano, G.; Bassi, A. Purpuric lesions on the eyelids developed after BNT162b2 mRNA COVID-19 vaccine: Another piece of SARS-CoV-2 skin puzzle? J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol.2021, 35, e543–e545. [Google Scholar] [CrossRef]
Lee, E.J.; Cines, D.B.; Gernsheimer, T.; Kessler, C.; Michel, M.; Tarantino, M.D.; Semple, J.W.; Arnold, D.M.; Godeau, B.; Lambert, M.P.; et al. Thrombocytopenia following Pfizer and Moderna SARS-CoV-2 vaccination. Am. J. Hematol.2021, 96, 534–537. [Google Scholar] [CrossRef]
Das, B.B.; Kohli, U.; Ramachandran, P.; Nguyen, H.H.; Greil, G.; Hussain, T.; Tandon, A.; Kane, C.; Avula, S.; Duru, C.; et al. Myopericarditis following mRNA COVID-19 Vaccination in Adolescents 12 through 18 Years of Age. J. Pediatr.2021, 238, 26–32.e1. [Google Scholar] [CrossRef]
McLaurin-Jiang, S.; Garner, C.D.; Krutsch, K.; Hale, T.W. Maternal and Child Symptoms Following COVID-19 Vaccination Among Breastfeeding Mothers. Breastfeed. Med.2021, 16, 702–709. [Google Scholar] [CrossRef]
Barda, N.; Dagan, N.; Ben-Shlomo, Y.; Kepten, E.; Waxman, J.; Ohana, R.; Hernan, M.A.; Lipsitch, M.; Kohane, I.; Netzer, D.; et al. Safety of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine in a Nationwide Setting. N. Engl. J. Med.2021, 385, 1078–1090. [Google Scholar] [CrossRef]
Baden, L.R.; El Sahly, H.M.; Essink, B.; Kotloff, K.; Frey, S.; Novak, R.; Diemert, D.; Spector, S.A.; Rouphael, N.; Creech, C.B.; et al. Efficacy and Safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 Vaccine. N. Engl. J. Med.2021, 384, 403–416. [Google Scholar] [CrossRef]
Sadoff, J.; Gray, G.; Vandebosch, A.; Cardenas, V.; Shukarev, G.; Grinsztejn, B.; Goepfert, P.A.; Truyers, C.; Fennema, H.; Spiessens, B.; et al. Safety and Efficacy of Single-Dose Ad26.COV2.S Vaccine against Covid-19. N. Engl. J. Med.2021, 384, 2187–2201. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Eichinger, S.; Warkentin, T.E.; Greinacher, A. Thrombotic Thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 Vaccination. Reply. N. Engl. J. Med.2021, 385, e11. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Doroftei, B.; Ciobica, A.; Ilie, O.D.; Maftei, R.; Ilea, C. Mini-Review Discussing the Reliability and Efficiency of COVID-19 Vaccines. Diagnostics2021, 11, 579. [Google Scholar] [CrossRef]
Zhang, L.; Richards, A.; Barrasa, M.I.; Hughes, S.H.; Young, R.A.; Jaenisch, R. Reverse-transcribed SARS-CoV-2 RNA can integrate into the genome of cultured human cells and can be expressed in patient-derived tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA2021, 118, e2105968118. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Tanaka, H.; Takata, N.; Sakurai, Y.; Yoshida, T.; Inoue, T.; Tamagawa, S.; Nakai, Y.; Tange, K.; Yoshioka, H.; Maeki, M.; et al. Delivery of Oligonucleotides Using a Self-Degradable Lipid-Like Material. Pharmaceutics2021, 13, 544. [Google Scholar] [CrossRef]
Sedic, M.; Senn, J.J.; Lynn, A.; Laska, M.; Smith, M.; Platz, S.J.; Bolen, J.; Hoge, S.; Bulychev, A.; Jacquinet, E.; et al. Safety Evaluation of Lipid Nanoparticle-Formulated Modified mRNA in the Sprague-Dawley Rat and Cynomolgus Monkey. Vet. Pathol.2018, 55, 341–354. [Google Scholar] [CrossRef]
Sato, Y.; Matsui, H.; Yamamoto, N.; Sato, R.; Munakata, T.; Kohara, M.; Harashima, H. Highly specific delivery of siRNA to hepatocytes circumvents endothelial cell-mediated lipid nanoparticle-associated toxicity leading to the safe and efficacious decrease in the hepatitis B virus. J. Control. Release2017, 266, 216–225. [Google Scholar] [CrossRef]
Gallud, A.; Munson, M.J.; Liu, K.; Idstrom, A.; Barriga, H.M.; Tabaei, S.; Aliakbarinodehi, N.; Ojansivu, M.; Lubart, Q.; Doutch, J.J.; et al. Time evolution of PEG-shedding and serum protein coronation determines the cell uptake kinetics and delivery of lipid nanoparticle. bioRxiv2021. [Google Scholar] [CrossRef]
Mita, P.; Wudzinska, A.; Sun, X.; Andrade, J.; Nayak, S.; Kahler, D.J.; Badri, S.; LaCava, J.; Ueberheide, B.; Yun, C.Y.; et al. LINE-1 protein localization and functional dynamics during the cell cycle. Elife2018, 7, e30058. [Google Scholar] [CrossRef]
Sato, Y.; Kinami, Y.; Hashiba, K.; Harashima, H. Different kinetics for the hepatic uptake of lipid nanoparticles between the apolipoprotein E/low density lipoprotein receptor and the N-acetyl-d-galactosamine/asialoglycoprotein receptor pathway. J. Control. Release2020, 322, 217–226. [Google Scholar] [CrossRef]
Vogel, A.B.; Kanevsky, I.; Che, Y.; Swanson, K.A.; Muik, A.; Vormehr, M.; Kranz, L.M.; Walzer, K.C.; Hein, S.; Guler, A.; et al. BNT162b vaccines protect rhesus macaques from SARS-CoV-2. Nature2021, 592, 283–289. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Bahl, K.; Senn, J.J.; Yuzhakov, O.; Bulychev, A.; Brito, L.A.; Hassett, K.J.; Laska, M.E.; Smith, M.; Almarsson, O.; Thompson, J.; et al. Preclinical and Clinical Demonstration of Immunogenicity by mRNA Vaccines against H10N8 and H7N9 Influenza Viruses. Mol. Ther.2017, 25, 1316–1327. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Bril, F.; Al Diffalha, S.; Dean, M.; Fettig, D.M. Autoimmune hepatitis developing after coronavirus disease 2019 (COVID-19) vaccine: Causality or casualty? J. Hepatol.2021, 75, 222–224. [Google Scholar] [CrossRef]
Kazazian, H.H., Jr.; Moran, J.V. Mobile DNA in Health and Disease. N. Engl. J. Med.2017, 377, 361–370. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Coffin, J.M.; Fan, H. The Discovery of Reverse Transcriptase. Annu. Rev. Virol.2016, 3, 29–51. [Google Scholar] [CrossRef]
Lander, E.S.; Linton, L.M.; Birren, B.; Nusbaum, C.; Zody, M.C.; Baldwin, J.; Devon, K.; Dewar, K.; Doyle, M.; FitzHugh, W.; et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature2001, 409, 860–921. [Google Scholar] [CrossRef]
Ostertag, E.M.; Goodier, J.L.; Zhang, Y.; Kazazian, H.H., Jr. SVA elements are nonautonomous retrotransposons that cause disease in humans. Am. J. Hum. Genet.2003, 73, 1444–1451. [Google Scholar] [CrossRef]
Hancks, D.C.; Kazazian, H.H., Jr. Active human retrotransposons: Variation and disease. Curr. Opin. Genet. Dev.2012, 22, 191–203. [Google Scholar] [CrossRef]
Jones, R.B.; Song, H.; Xu, Y.; Garrison, K.E.; Buzdin, A.A.; Anwar, N.; Hunter, D.V.; Mujib, S.; Mihajlovic, V.; Martin, E.; et al. LINE-1 retrotransposable element DNA accumulates in HIV-1-infected cells. J. Virol.2013, 87, 13307–13320. [Google Scholar] [CrossRef]
Macchietto, M.G.; Langlois, R.A.; Shen, S.S. Virus-induced transposable element expression up-regulation in human and mouse host cells. Life Sci. Alliance2020, 3, e201900536. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Yin, Y.; Liu, X.Z.; He, X.; Zhou, L.Q. Exogenous Coronavirus Interacts With Endogenous Retrotransposon in Human Cells. Front. Cell Infect. Microbiol.2021, 11, 609160. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Belancio, V.P.; Roy-Engel, A.M.; Deininger, P. The impact of multiple splice sites in human L1 elements. Gene2008, 411, 38–45. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Dai, L.; Taylor, M.S.; O’Donnell, K.A.; Boeke, J.D. Poly(A) binding protein C1 is essential for efficient L1 retrotransposition and affects L1 RNP formation. Mol. Cell Biol.2012, 32, 4323–4336. [Google Scholar] [CrossRef]
Suzuki, Y.; Craigie, R. The road to chromatin—Nuclear entry of retroviruses. Nat. Rev. Microbiol.2007, 5, 187–196. [Google Scholar] [CrossRef]
Shi, J.; Wang, X.; Lyu, L.; Jiang, H.; Zhu, H.J. Comparison of protein expression between human livers and the hepatic cell lines HepG2, Hep3B, and Huh7 using SWATH and MRM-HR proteomics: Focusing on drug-metabolizing enzymes. Drug Metab. Pharmacokinet.2018, 33, 133–140. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Kubo, S.; Seleme, M.C.; Soifer, H.S.; Perez, J.L.; Moran, J.V.; Kazazian, H.H., Jr.; Kasahara, N. L1 retrotransposition in nondividing and primary human somatic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA2006, 103, 8036–8041. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Macia, A.; Widmann, T.J.; Heras, S.R.; Ayllon, V.; Sanchez, L.; Benkaddour-Boumzaouad, M.; Munoz-Lopez, M.; Rubio, A.; Amador-Cubero, S.; Blanco-Jimenez, E.; et al. Engineered LINE-1 retrotransposition in nondividing human neurons. Genome Res.2017, 27, 335–348. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] Source: https://www.mdpi.com/1467-3045/44/3/73/htm
Η Μετάφραση του άρθρου
Eνδοκυτταρική αντίστροφη μεταγραφή του εμβολίου Pfizer BioNTech COVID-19 mRNA BNT162b2 In vitro σε κυτταρική σειρά ανθρώπινου ήπατος
1
Department of Clinical Sciences, Lund University, 20502 Malmö, Sweden
2
Infection Medicine, Department of Clinical Sciences, Lund University, 22362 Lund, Sweden
*
Συγγραφέας στον οποίο πρέπει να απευθύνεται η αλληλογραφία.
Οι προκλινικές μελέτες του εμβολίου mRNA του COVID-19 BNT162b2, που αναπτύχθηκε από την Pfizer και τη BioNTech, έδειξαν αναστρέψιμες ηπατικές επιδράσεις σε ζώα που έλαβαν την ένεση BNT162b2. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι το RNA του SARS-CoV-2 μπορεί να αντιστραφεί και να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα των ανθρώπινων κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την επίδραση του BNT162b2 στην κυτταρική σειρά ανθρώπινου ήπατος Huh7 in vitro. Τα κύτταρα Huh7 εκτέθηκαν σε BNT162b2 και πραγματοποιήθηκε ποσοτική PCR σε RNA που εκχυλίστηκε από τα κύτταρα. Ανιχνεύσαμε υψηλά επίπεδα BNT162b2 σε κύτταρα Huh7 και αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση του μακράς διάσπαρτου πυρηνικού στοιχείου-1 (LINE-1), που είναι μια ενδογενής αντίστροφη μεταγραφάση. Η ανοσοϊστοχημεία που χρησιμοποιεί δέσμευση αντισώματος με LINE-1 ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης-1 πρωτεΐνη δέσμευσης RNA (ORFp1) σε κύτταρα Huh7 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με BNT162b2 έδειξε αυξημένη κατανομή πυρήνα της LINE-1. Η PCR σε γονιδιωματικό DNA κυττάρων Huh7 που εκτέθηκαν σε BNT162b2 ενίσχυσε την αλληλουχία DNA μοναδική για το BNT162b2. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν γρήγορη πρόσληψη του BNT162b2 στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά του ήπατος Huh7, που οδηγεί σε αλλαγές στην έκφραση και κατανομή της LINE-1. Δείχνουμε επίσης ότι το mRNA του BNT162b2 μεταγράφεται αντίστροφα ενδοκυτταρικά στο DNA σε μόλις 6 ώρες μετά την έκθεση στο BNT162b2.
Η νόσος του κορωνοϊού 2019 (COVID-19) που προκαλείται από σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο Ο κορωνοϊός 2 (SARS-CoV-2) ανακοινώθηκε από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (ΠΟΥ) ως παγκόσμια πανδημία στις 11 Μαρτίου 2020 και εμφανίστηκε ως καταστροφική κρίση υγείας . Από τον Φεβρουάριο του 2022, ο COVID-19 έχει οδηγήσει σε περισσότερα από 430 εκατομμύρια αναφερόμενα κρούσματα μόλυνσης και 5,9 εκατομμύρια θανάτους παγκοσμίως [ 1 ]. Απαιτούνται επειγόντως αποτελεσματικά και ασφαλή εμβόλια για τη μείωση των ποσοστών νοσηρότητας και θνησιμότητας που σχετίζονται με τον COVID-19.
Έχουν αναπτυχθεί αρκετά εμβόλια για τον COVID-19, με ιδιαίτερη έμφαση στα εμβόλια mRNA (από την Pfizer-BioNTech και τη Moderna), στα εμβόλια ανασυνδυασμένου αδενοϊικού φορέα με ελαττωματικά αντιγραφή (από τους Janssen-Johnson and Johnson, Astra-Zeneca, Sputnik-V και CanSino ), και αδρανοποιημένα εμβόλια (από Sinopharm, Bharat Biotech και Sinovac). Το εμβόλιο mRNA έχει τα πλεονεκτήματα ότι είναι ευέλικτο και αποτελεσματικό στο σχεδιασμό και την κατασκευή ανοσογόνου, και επί του παρόντος, πολλά υποψήφια εμβόλια βρίσκονται σε διάφορα στάδια ανάπτυξης και εφαρμογής. Συγκεκριμένα, το εμβόλιο COVID-19 mRNA BNT162b2 που αναπτύχθηκε από την Pfizer και τη BioNTech έχει αξιολογηθεί σε επιτυχημένες κλινικές δοκιμές [ 2 , 3 , 4 ] και έχει χορηγηθεί σε εθνικές εκστρατείες εμβολιασμού για τον COVID-19 σε διάφορες περιοχές σε όλο τον κόσμο [ 5 , 6 , 7 , 8 ].
Το BNT162b2 είναι ένα εμβόλιο RNA τροποποιημένο με νουκλεοσίδια (modRNA) ενθυλακωμένο με νανοσωματίδια λιπιδίων (LNP) και κωδικοποιεί την πρωτεΐνη ακίδας (S) SARS-CoV-2 πλήρους μήκους, τροποποιημένη από δύο μεταλλάξεις προλίνης για να εξασφαλίσει αντιγονικά βέλτιστη διαμόρφωση πριν από τη σύντηξη , που μιμείται τον άθικτο ιό για να προκαλέσει αντισώματα εξουδετέρωσης του ιού [ 3 ]. Σε συμφωνία με τυχαιοποιημένες κλινικές δοκιμές, το BNT162b2 έδειξε υψηλή αποτελεσματικότητα σε ένα ευρύ φάσμα αποτελεσμάτων που σχετίζονται με τον COVID-19 σε πραγματικό περιβάλλον [ 5 ]. Ωστόσο, εξακολουθούν να υπάρχουν πολλές προκλήσεις, συμπεριλαμβανομένης της παρακολούθησης για μακροπρόθεσμη ασφάλεια και αποτελεσματικότητα του εμβολίου. Αυτό απαιτεί περαιτέρω αξιολόγηση και έρευνες. Το προφίλ ασφάλειας του BNT162b2 είναι προς το παρόν διαθέσιμο μόνο από βραχυπρόθεσμες κλινικές μελέτες. έχουν αναφερθεί, όπως περικαρδίτιδα, αρρυθμία, εν τω βάθει φλεβική θρόμβωση, πνευμονική εμβολή 4 , 9 , 10 , 21,4,31 αιμορραγία BNT162b2 θρομβοπενία [ μυοκαρδίου και έμφραγμα του , ενδοκρανιακή , 17 , 18 , 19 , 20 ]. Υπάρχουν επίσης μελέτες που αναφέρουν ανεπιθύμητες ενέργειες που παρατηρήθηκαν σε άλλους τύπους εμβολίων [ 21 , 22 , 23 , 24 ]. Για την καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών στους οποίους βασίζονται οι ανεπιθύμητες ενέργειες που σχετίζονται με το εμβόλιο, απαιτούνται κλινικές έρευνες καθώς και κυτταρικές και μοριακές αναλύσεις.
Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι τα RNA του SARS-CoV-2 μπορούν να μεταγραφούν αντίστροφα και να ενσωματωθούν στο γονιδίωμα των ανθρώπινων κυττάρων [ 25 ]. Αυτό γεννά το ερώτημα εάν αυτό μπορεί να συμβεί και με το BNT162b2, το οποίο κωδικοποιεί μερικό RNA του SARS-CoV-2. Στα φαρμακοκινητικά δεδομένα που παρέχονται από την Pfizer στον Ευρωπαϊκό Οργανισμό Φαρμάκων (EMA), η βιοκατανομή του BNT162b2 μελετήθηκε σε ποντίκια και αρουραίους με ενδομυϊκή ένεση με ραδιοσημασμένο LNP και λουσιφεράση modRNA. Η ραδιενέργεια ανιχνεύθηκε στους περισσότερους ιστούς από το πρώτο χρονικό σημείο (0,25 ώρες) και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το σημείο της ένεσης και το ήπαρ ήταν οι κύριες θέσεις κατανομής, με μέγιστες συγκεντρώσεις που παρατηρήθηκαν στις 8-48 ώρες μετά τη δόση [ 26 ]. Επιπλέον, σε ζώα που έλαβαν την ένεση BNT162b2, παρατηρήθηκαν αναστρέψιμες ηπατικές επιδράσεις, συμπεριλαμβανομένης της διόγκωσης του ήπατος, της δημιουργίας κενοτοπίων, των αυξημένων επιπέδων γ-γλουταμυλ τρανσφεράσης (γGT) και των αυξημένων επιπέδων ασπαρτικής τρανσαμινάσης (AST) και αλκαλικής φωσφατάσης (ALP) [ 26 ]. Παροδικές ηπατικές επιδράσεις που προκαλούνται από συστήματα χορήγησης LNP έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [ 27 , 28 , 29 , 30 ], ωστόσο, έχει επίσης αποδειχθεί ότι το κενό LNP χωρίς modRNA από μόνο του δεν εισάγει καμία σημαντική ηπατική βλάβη [ 27 ]. Επομένως, σε αυτή τη μελέτη, στοχεύουμε να εξετάσουμε την επίδραση του BNT162b2 σε μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά ήπατος in vitro και να διερευνήσουμε εάν το BNT162b2 μπορεί να μεταγραφεί αντίστροφα στο DNA μέσω ενδογενών μηχανισμών.
2. Υλικά και μέθοδοι
2.1. Κυτταρικής καλλιέργειας
Τα κύτταρα Huh7 (JCRB Cell Bank, Osaka, Japan) καλλιεργήθηκαν σε 37 °C σε 5% CO 2 με μέσο DMEM (HyClone, HYCLSH30243.01) συμπληρωμένο με 10% ( v / v ) εμβρυϊκό βόειο ορό (Sigma-Aldrich, F7524 -500ML, Burlington, MA, ΗΠΑ) και 1% ( v / v ) πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (HyClone, SV30010, Logan, UT, USA). Για την επεξεργασία BNT162b2, κύτταρα Huh7 σπάρθηκαν με πυκνότητα 200.000 κυττάρων/φρεάτιο σε πλάκες 24 φρεατίων. Το εμβόλιο mRNA BNT162b2 (Pfizer BioNTech, Νέα Υόρκη, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) αραιώθηκε με στείρα ένεση χλωριούχου νατρίου 0,9%, USP σε τελική συγκέντρωση 100 μg/mL όπως περιγράφεται στις οδηγίες του κατασκευαστή [ 31 ]. Το εναιώρημα BNT162b2 προστέθηκε στη συνέχεια σε μέσα κυτταροκαλλιέργειας για να φτάσει σε τελικές συγκεντρώσεις 0,5, 1,0 ή 2,0 μg/mL. Τα κύτταρα Huh7 επωάστηκαν με ή χωρίς BNT162b2 για 6, 24 και 48 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν καλά με PBS και συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και αποθηκεύτηκαν στους -80 °C μέχρι περαιτέρω χρήση.
2.2. RT-QPCR σε πραγματικό χρόνο
Το RNA από τα κύτταρα εκχυλίστηκε με RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, 74134, Hilden, Γερμανία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η RT-PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ σύνθεσης cDNA First Strand RevertAid (Thermo Fisher Scientific, K1622, Waltham, MA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Πραγματοποιήθηκε qPCR σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, K0222, Waltham, MA, USA) με εκκινητές για BNT162b2, LINE-1 και γονίδια housekeeping ACTB και GAPDH ( Πίνακας 1 ).
Τραπέζι 1. Αλληλουχίες εκκινητών RT-qPCR και PCR.
2.3. Ανοσοφθορισμός χρώση και ομοεστιακή απεικόνιση
Τα κύτταρα Huh7 καλλιεργήθηκαν σε πλακίδια οκτώ θαλάμων (LAB-TEK, 154534, Santa Cruz, CA, USA) με πυκνότητα 40.000 κυττάρων/φρεάτιο, με ή χωρίς BNT162b2 (0,5, 1 ή 2 μg/mL) για 6 ώρες. Η ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιήθηκε με τη χρήση πρωτογενούς αντισώματος anti-LINE-1 ORF1p μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού (Merck, 3574308, Kenilworth, NJ, USA), δευτερογενούς αντισώματος Cy3 Donkey anti-mouse (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) και Hoechst (Life technology, 34850, Carlsbad, CA, USA), ακολουθώντας το πρωτόκολλο της Thermo Fisher (Waltham, MA, USA). Λήφθηκαν δύο εικόνες ανά συνθήκη χρησιμοποιώντας ένα Zeiss LSM 800 και έναν αντικειμενικό εμβάπτισης λαδιού 63Χ και η ένταση χρώσης ποσοτικοποιήθηκε στην επιμέρους περιοχή ολόκληρου του κυττάρου και στην περιοχή του πυρήνα σε 15 κύτταρα ανά εικόνα με ImageJ 1.53c. Η ένταση χρώσης LINE-1 για το κυτοσόλιο υπολογίστηκε αφαιρώντας την ένταση του πυρήνα από αυτή ολόκληρου του κυττάρου. Σε όλες τις εικόνες των κελιών εκχωρήθηκε ένας τυχαίος αριθμός για να αποφευχθεί η μεροληψία. Για τη σήμανση των πυρήνων (που προσδιορίζονται με τη χρώση Hoechst) και των ολόκληρων κυττάρων (που καθορίζονται από τα όρια του φθορισμού LINE-1), χρησιμοποιήθηκε το εργαλείο επιλογής Freehand. Στη συνέχεια μετρήθηκαν αυτές οι περιοχές και η μέση ένταση χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των ομάδων.
Το γονιδιωματικό DNA εκχυλίστηκε από σφαιρίδια κυττάρων με ρυθμιστικό PBND (10 mM Tris-HCl ρΗ 8,3, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,45% NP-40, 0,45% Tween-20) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφηκε προηγουμένως [ 32 ]. Για την απομάκρυνση του υπολειμματικού RNA από το παρασκεύασμα DNA, RNase (100 μg/mL, Qiagen, Hilden, Γερμανία) προστέθηκε στο παρασκεύασμα DNA και επωάστηκε στους 37 °C για 3 ώρες, ακολουθούμενο από 5 λεπτά στους 95 °C. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε η PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές που στοχεύουν το BNT162b2 (οι αλληλουχίες φαίνονται στον Πίνακα 1 ), με το ακόλουθο πρόγραμμα: 5 λεπτά στους 95 °C, 35 κύκλοι στους 95 °C για 30 δευτερόλεπτα, 58 °C για 30 δευτερόλεπτα και 72 °C για 1 λεπτό? Τέλος, 72 °C για 5 λεπτά και 12 °C για 5 λεπτά. Τα προϊόντα PCR χρησιμοποιήθηκαν σε β / ο πήκτωμα αγαρόζης Οι ζώνες που αντιστοιχούν στα αμπλικόνια του αναμενόμενου μεγέθους (444 bps) κόπηκαν και το DNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ καθαρισμού QIAquick PCR (Qiagen, 28104, Hilden, Γερμανία), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η αλληλουχία του ενισχυτικού DNA επαληθεύτηκε με προσδιορισμό αλληλουχίας Sanger (Eurofins Genomics, Ebersberg, Γερμανία).
Στατιστική
-test Student t και ANOVA. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM ή ± SD. διαφορές με p < 0,05 θεωρούνται σημαντικές.
2.5. Ηθικές Δηλώσεις
Η κυτταρική σειρά Huh7 ελήφθη από την Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB) Cell Bank.
3. Αποτελέσματα
3.1. Το BNT162b2 εισέρχεται σε κύτταρα ανθρώπινης ηπατικής γραμμής Huh7 σε υψηλή απόδοση
Για να προσδιορίσουμε εάν το BNT162b2 εισέρχεται σε ανθρώπινα ηπατικά κύτταρα, εκθέσαμε την ανθρώπινη ηπατική κυτταρική σειρά Huh7 σε BNT162b2. Σε μια προηγούμενη μελέτη σχετικά με την κινητική πρόσληψης της παροχής LNP σε κύτταρα Huh7, η μέγιστη βιολογική αποτελεσματικότητα του LNP παρατηρήθηκε μεταξύ 4-7 ωρών [ 33 ]. Επομένως, στη μελέτη μας, τα κύτταρα Huh7 καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς αυξανόμενες συγκεντρώσεις BNT162b2 (0,5, 1,0 και 2,0 μg/mL) για 6, 24 και 48 ώρες. RNA εξήχθη από κύτταρα και διεξήχθη αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ποσοτικής αντίστροφης μεταγραφής σε πραγματικό χρόνο (RT-qPCR) χρησιμοποιώντας εκκινητές που στοχεύουν την αλληλουχία BNT162b2, όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 1 . Η πλήρης αλληλουχία του BNT162b2 είναι δημόσια διαθέσιμη [ 34 ] και περιέχει ένα καπάκι δύο νουκλεοτιδίων. 5′- αμετάφραστη περιοχή (UTR) που ενσωματώνει το 5′ -UTR ενός γονιδίου ανθρώπινης α-σφαιρίνης. την πλήρους μήκους πρωτεΐνη SARS-CoV-2 S με δύο μεταλλάξεις προλίνης. 3′-UTR που ενσωματώνει το ανθρώπινο μιτοχονδριακό τμήμα 12S rRNA (mtRNR1) και το ανθρώπινο τμήμα γονιδίου AES/TLE5 με δύο μεταλλάξεις C→U. πολυ(Α) ουρά. Λεπτομερής ανάλυση της αλληλουχίας πρωτεΐνης S στο BNT162b2 αποκάλυψε 124 αλληλουχίες που είναι 100% πανομοιότυπες με τις αλληλουχίες ανθρώπινου γονιδιώματος και τρεις αλληλουχίες με μόνο ένα νουκλεοτίδιο (nt) αναντιστοιχία σε 19-26 nts ( Πίνακας S1, βλέπε Συμπληρωματικά Υλικά ). Για να ανιχνεύσουμε το επίπεδο RNA BNT162b2, σχεδιάσαμε εκκινητές με εμπρόσθιο εκκινητή που βρίσκεται σε περιοχές πρωτεΐνης SARS-CoV-2 S και αντίστροφο εκκινητή σε 3′-UTR, που επιτρέπει την ανίχνευση του αμπλικονίου PCR μοναδικό για το BNT162b2 χωρίς μη ειδική δέσμευση των εκκινητών με τις ανθρώπινες γονιδιωματικές περιοχές .
Φιγούρα 1. Σετ εκκινητών PCR που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση του επιπέδου mRNA και την αντίστροφη μεταγραφή του BNT162b2. Η απεικόνιση του BNT162b2 προσαρμόστηκε από βιβλιογραφία που περιγράφηκε προηγουμένως [ 34 ].
Τα αποτελέσματα RT-qPCR έδειξαν ότι τα κύτταρα Huh7 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BNT162b2 είχαν υψηλά επίπεδα mRNA BNT162b2 σε σχέση με τα γονίδια οικιακής φροντίδας στις 6, 24 και 48 ώρες ( Σχήμα 2 , που παρουσιάζεται σε καταγεγραμμένο 2 -ΔΔCT λόγω εξαιρετικά υψηλών επιπέδων). Οι τρεις συγκεντρώσεις BNT162b2 οδήγησαν σε παρόμοια ενδοκυτταρικά επίπεδα mRNA BNT162b2 σε διαφορετικά χρονικά σημεία, εκτός από το ότι η σημαντική διαφορά μεταξύ 1,0 και 2,0 μg/mL παρατηρήθηκε στις 48 ώρες. Τα επίπεδα mRNA του BNT162b2 μειώθηκαν σημαντικά στις 24 ώρες σε σύγκριση με τις 6 ώρες, αλλά αυξήθηκαν ξανά στις 48 ώρες.
Σχήμα 2. Επίπεδα mRNA BNT162b2 σε κύτταρα Huh7 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BNT162b2. Τα κύτταρα Huh7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χωρίς (Ctrl) ή με 0,5 (V1), 1 (V2) και 2 μg/mL (V3) BNT162b2 για 6 (πράσινες κουκκίδες), 24 (πορτοκαλί κουκκίδες) και 48 ώρες (μπλε κουκκίδες) . Το RNA καθαρίστηκε και εκτελέστηκε qPCR χρησιμοποιώντας εκκινητές που στοχεύουν το BNT162b2. Τα επίπεδα RNA του BNT162b2 παρουσιάζονται ως καταγεγραμμένες τιμές 2 -ΔΔCT σε σχέση με τα γονίδια οικιακής χρήσης GAPDH και ACTB . Τα αποτελέσματα προέρχονται από πέντε ανεξάρτητα πειράματα ( n = 5). Οι διαφορές μεταξύ των αντίστοιχων ομάδων αναλύθηκαν με τη χρήση t-test Student δύο ουρών . Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM. (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 έναντι του αντίστοιχου ελέγχου σε κάθε χρονικό σημείο ή όπως υποδεικνύεται).
3.2. Επίδραση του BNT162b2 σε Ανθρώπινη Ενδογενή Αντίστροφη Μεταγραφάση Μακράς Διάσπαρτου Πυρηνικού Στοιχείου-1 (LINE-1)
Εδώ εξετάσαμε την επίδραση του BNT162b2 στην LINE-1 . Η RT-qPCR πραγματοποιήθηκε σε RNA καθαρισμένο από κύτταρα Huh7 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BNT162b2 (0, 0,5, 1,0 και 2,0 μg/mL) για 6, 24 και 48 ώρες, χρησιμοποιώντας εκκινητές που στοχεύουν τη LINE-1 . Σημαντικά αυξημένη LINE-1 σε σύγκριση με τον έλεγχο παρατηρήθηκε στις 6 ώρες κατά 2,0 μg/mL BNT162b2, ενώ χαμηλότερες συγκεντρώσεις BNT162b2 μείωσαν LINE-1 σε όλα τα χρονικά σημεία ( Εικόνα 3 ).
Σχήμα 3. LINE-1 σε κύτταρα Huh7 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BNT162b2. Τα κύτταρα Huh7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χωρίς (Ctrl) ή με 0,5 (V1), 1 (V2) και 2 μg/mL (V3) BNT162b2 για 6 (πράσινες κουκκίδες), 24 (κόκκινες κουκκίδες) και 48 ώρες (μπλε κουκκίδες) . Το RNA καθαρίστηκε και εκτελέστηκε qPCR χρησιμοποιώντας εκκινητές που στοχεύουν τη LINE-1 . Τα επίπεδα RNA της LINE-1 παρουσιάζονται ως τιμές 2 -ΔΔCT σε σχέση με τα γονίδια οικιακής χρήσης GAPDH και ACTB . Τα αποτελέσματα προέρχονται από πέντε ανεξάρτητα πειράματα ( n = 5). Οι διαφορές μεταξύ των αντίστοιχων ομάδων αναλύθηκαν με τη χρήση t-test Student δύο ουρών . Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM. (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 έναντι του αντίστοιχου ελέγχου σε κάθε χρονικό σημείο, ή όπως υποδεικνύεται, † p < 0,05 έναντι 6 h-Ctrl).
Στη συνέχεια, μελετήσαμε την επίδραση του BNT162b2 στο επίπεδο πρωτεΐνης LINE-1. Η πλήρους μήκους LINE-1 αποτελείται από μια αμετάφραστη περιοχή 5′ (UTR), δύο ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (ORFs), ORF1 και ORF2 και ένα 3’UTR, από το οποίο το ORF1 είναι μια πρωτεΐνη που δεσμεύει RNA με δραστηριότητα συνοδού. Η δραστηριότητα ρετρομετάθεσης της LINE-1 έχει αποδειχθεί ότι περιλαμβάνει μετατόπιση ORF1 στον πυρήνα [ 35 ]. Κύτταρα Huh7 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς BNT162b2 (0,5, 1,0 και 2,0 μg/mL) για 6 ώρες μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με αντισώματα που συνδέονται με το LINE-1 ORF1p και ειδικό για το DNA ανιχνευτή Hoechst για οπτικοποίηση του κυτταρικού πυρήνα ( Εικόνα 4 α). Η ποσοτικοποίηση της έντασης χρώσης με ανοσοφθορισμό έδειξε ότι το BNT162b2 αύξησε τα επίπεδα πρωτεΐνης LINE-1 ORF1p τόσο σε ολόκληρη την περιοχή του κυττάρου όσο και στον πυρήνα σε όλες τις συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν ( Εικόνα 4 b–d).
Εικόνα 4. Ανοσοϊστοχημεία κυττάρων Huh7 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BNT162b2 σε κατανομή πρωτεΐνης LINE-1. Τα κύτταρα Huh7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χωρίς (Ctrl) ή με 0,5, 1 και 2 μg/mL BNT162b2 για 6 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με αντισώματα που συνδέονται με το LINE-1 ORF1p (κόκκινο) και τον ειδικό για DNA ανιχνευτή Hoechst για οπτικοποίηση του κυτταρικού πυρήνα (μπλε). ( α ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες της έκφρασης LINE-1 σε κύτταρα Huh7 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς BNT162b2. ( β – δ ) Ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης LINE-1 σε ολόκληρη την κυτταρική περιοχή ( b ), το κυτοσόλιο ( c ) και τον πυρήνα ( d ). Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας One-Way ANOVA και δημιουργήθηκαν γραφήματα χρησιμοποιώντας GraphPad Prism V 9.2. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD (** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 όπως υποδεικνύεται).
3.3. Ανίχνευση Αντίστροφης Μεταγραφής BNT162b2 DNA σε κύτταρα Huh7
Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η είσοδος της πρωτεΐνης LINE-1 στον πυρήνα σχετίζεται με ρετρομετάθεση [ 35 ]. Στο πείραμα χρώσης με ανοσοφθορισμό που περιγράφηκε παραπάνω, αυξημένα επίπεδα LINE-1 στον πυρήνα παρατηρήθηκαν ήδη στη χαμηλότερη συγκέντρωση BNT162b2 (0,5 μg/mL). Για να εξετάσουμε εάν το BNT162b2 μεταγράφεται αντίστροφα σε DNA όταν η LINE-1 είναι αυξημένη, καθαρίσαμε το γονιδιωματικό DNA από κύτταρα Huh7 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,5 μg/mL BNT162b2 για 6, 24 και 48 ώρες. καθαρισμένο DNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RNase για να απομακρυνθεί το RNA και υποβλήθηκε σε PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές που στοχεύουν το BNT162b2, όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 1 . Τα ενισχυμένα θραύσματα ϋΝΑ στη συνέχεια οπτικοποιήθηκαν με ηλεκτροφόρηση και καθαρίστηκαν με πήκτωμα ( Εικόνα 5 ). Τα αμπλικόνια DNA BNT162b2 ανιχνεύθηκαν και στα τρία χρονικά σημεία (6, 24 και 48 ώρες). Η αλληλουχία Sanger επιβεβαίωσε ότι τα αμπλικόνια DNA ήταν πανομοιότυπα με την αλληλουχία BNT162b2 που πλαισιώνεται από τους εκκινητές ( Πίνακας 2 ). Για να διασφαλίσουμε ότι τα αμπλικόνια DNA προέρχονταν από DNA αλλά όχι από BNT162b2 RNA, πραγματοποιήσαμε επίσης PCR σε RNA καθαρισμένο από κύτταρα Huh7 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,5 μg/mL BNT162b2 για 6 ώρες, με ή χωρίς θεραπεία με RNase (Ctrl 5 και 6 in Σχήμα 5 ), και δεν ανιχνεύθηκε αμπλικόνιο στα δείγματα RNA που υποβλήθηκαν σε PCR.
Εικόνα 5. Ανίχνευση αμπλικονίων DNA του BNT162b2 σε κύτταρα Huh7 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BNT162b2. Τα κύτταρα Huh7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χωρίς (Ctrl) ή με 0,5 μg/mL BNT162b2 για 6, 24 και 48 ώρες. Το γονιδιωματικό DNA καθαρίστηκε και υποβλήθηκε σε πέψη με 100 μg/mL RNase. Η PCR εκτελέστηκε σε όλα τα δείγματα με εκκινητές που στοχεύουν το BNT162b2, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 και στον Πίνακα 1 . Τα αμπλικόνια DNA (444 bps) εμφανίστηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης. BNT: BNT162b2; L: Κλίμακα DNA; Ctrl1: καλλιεργημένα κύτταρα Huh7. Ctrl2: Κύτταρα Huh7 χωρίς επεξεργασία BNT162b2 που συλλέχθηκαν στις 6 ώρες. Ctrl3: Κύτταρα Huh7 χωρίς επεξεργασία BNT162b2 που συλλέχθηκαν στις 24 ώρες. Ctrl4: Κύτταρα Huh7 χωρίς επεξεργασία BNT162b2 που συλλέχθηκαν στις 48 ώρες. Ctrl5: RNA από κύτταρα Huh7 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,5 μg/mL BNT162b2 για 6 ώρες. Ctrl6: RNA από κύτταρα Huh7 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,5 μg/mL BNT162b2 για 6 ώρες, χωνευμένο με RNase.
Πίνακας 2. Αποτέλεσμα αλληλουχίας Sanger του ενισχυτικού BNT162b2.
4. Συζήτηση
Σε αυτή τη μελέτη παρουσιάζουμε στοιχεία ότι το εμβόλιο mRNA του COVID-19 BNT162b2 μπορεί να εισέλθει στην κυτταρική σειρά ανθρώπινου ήπατος Huh7 in vitro. Το mRNA του BNT162b2 μεταγράφεται αντίστροφα ενδοκυτταρικά στο DNA τόσο γρήγορα όσο 6 ώρες μετά την έκθεση στο BNT162b2. Ένας πιθανός μηχανισμός για την αντίστροφη μεταγραφή είναι μέσω της ενδογενούς ανάστροφης μεταγραφάσης LINE-1, και η κατανομή πρωτεΐνης πυρήνα της LINE-1 αυξάνεται από το BNT162b2.
Η ενδοκυτταρική συσσώρευση LNP στα ηπατοκύτταρα έχει αποδειχθεί in vivo [ 36 ]. Μια προκλινική μελέτη για το BNT162b2 έδειξε ότι το BNT162b2 εισέρχεται στα κύτταρα HEK293T της ανθρώπινης κυτταρικής σειράς και οδηγεί σε ισχυρή έκφραση του αντιγόνου BNT162b2 [ 37 ]. Επομένως, σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε αρχικά την είσοδο του BNT162b2 στα κύτταρα Huh7 της ανθρώπινης κυτταρικής σειράς ήπατος. Η επιλογή των συγκεντρώσεων BNT162b2 που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη δικαιολογεί εξήγηση. Το BNT162b2 χορηγείται ως μια σειρά δύο δόσεων με διαφορά τριών εβδομάδων και κάθε δόση περιέχει 30 μg BNT162b2 σε όγκο 0,3 mL, γεγονός που καθιστά την τοπική συγκέντρωση στο σημείο της ένεσης στο υψηλότερο 100 μg/mL [ 31 ]. Μια προηγούμενη μελέτη για τα εμβόλια mRNA κατά των ιών γρίπης H10N8 και H7N9 χρησιμοποιώντας ένα παρόμοιο σύστημα χορήγησης LNP έδειξε ότι το εμβόλιο mRNA μπορεί να κατανεμηθεί μάλλον μη ειδικά σε πολλά όργανα όπως το ήπαρ, ο σπλήνας, η καρδιά, τα νεφρά, οι πνεύμονες και ο εγκέφαλος και η συγκέντρωση στο το συκώτι είναι περίπου 100 φορές χαμηλότερο από αυτό του σημείου της ενδομυϊκής ένεσης [ 38 ]. Στην έκθεση αξιολόγησης του BNT162b2 που παρασχέθηκε στον EMA από την Pfizer, οι μελέτες φαρμακοκινητικής κατανομής σε αρουραίους έδειξαν ότι ένα σχετικά μεγάλο ποσοστό (έως 18%) της συνολικής δόσης κατανέμεται στο ήπαρ [ 26 ]. Ως εκ τούτου, επιλέξαμε να χρησιμοποιήσουμε 0,5, 1 και 2 μg/mL εμβολίου στα πειράματά μας στα ηπατικά κύτταρα. Ωστόσο, η επίδραση ενός ευρύτερου εύρους χαμηλότερων και υψηλότερων συγκεντρώσεων BNT162b2 θα πρέπει επίσης να επαληθευτεί σε μελλοντικές μελέτες.
Στην τρέχουσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά ήπατος για in vitro έρευνα. Αξίζει να διερευνηθεί εάν τα ηπατικά κύτταρα παρουσιάζουν επίσης την πρωτεΐνη ακίδας SARS-CoV-2 που προέρχεται από το εμβόλιο, η οποία θα μπορούσε δυνητικά να καταστήσει τα ηπατικά κύτταρα στόχους για κυτταροτοξικά Τ κύτταρα που αντιδρούν με πρωτεΐνες ακίδας. Έχουν υπάρξει αναφορές περιστατικών σε άτομα που ανέπτυξαν αυτοάνοση ηπατίτιδα [ 39 ] μετά τον εμβολιασμό BNT162b2. Για την καλύτερη κατανόηση των πιθανών επιδράσεων του BNT162b2 στην ηπατική λειτουργία, είναι επιθυμητά μοντέλα in vivo για μελλοντικές μελέτες.
Στην έκθεση τοξικότητας BNT162b2, δεν έχουν παρασχεθεί μελέτες γονοτοξικότητας ή καρκινογένεσης [ 26 ]. Η μελέτη μας δείχνει ότι το BNT162b2 μπορεί να μεταγραφεί αντίστροφα σε DNA στην ηπατική κυτταρική σειρά Huh7 και αυτό μπορεί να προκαλέσει ανησυχία εάν το DNA που προέρχεται από BNT162b2 μπορεί να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του ξενιστή και να επηρεάσει την ακεραιότητα του γονιδιωματικού DNA, το οποίο μπορεί να μεσολαβήσει δυνητικά γονιδιοτοξικά παρενέργειες. Σε αυτό το στάδιο, δεν γνωρίζουμε εάν το DNA που μεταγράφεται αντίστροφα από το BNT162b2 είναι ενσωματωμένο στο γονιδίωμα του κυττάρου. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να καταδειχθεί η επίδραση του BNT162b2 στη γονιδιωματική ακεραιότητα, συμπεριλαμβανομένης της αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος των κυττάρων που εκτέθηκαν στο BNT162b2, καθώς και των ιστών από ανθρώπινα υποκείμενα που έλαβαν εμβολιασμό BNT162b2.
Το ανθρώπινο αυτόνομο ρετροτρανσποζόνιο LINE-1 είναι μια κυτταρική ενδογενής αντίστροφη τρανσκριπτάση και το μόνο εναπομείναν ενεργό τρανσποζόνιο στον άνθρωπο, ικανό να ρετρομεταθέτει τον εαυτό του και άλλα μη αυτόνομα στοιχεία [ 40 , 41 ], και ~17% του ανθρώπινου γονιδιώματος αποτελείται από αλληλουχίες LINE-1 [ 42 ]. Τα Alu , σύντομα, διάσπαρτα νουκλεοτιδικά στοιχεία (SINEs), μεταβλητός αριθμός διαδοχικών επαναλήψεων (VNTR), καθώς και κυτταρικά επεξεργασμένα από mRNA ψευδογονίδια, μεταφέρονται εκ των υστέρων από τις πρωτεΐνες ρετρομεταφοράς LINE-1 που λειτουργούν σε trans [ 43 , 44 ]. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η ενδογενής LINE-1 μεσολαβεί στην αντίστροφη μεταγραφή και ενσωμάτωση των αλληλουχιών SARS-CoV-2 στα γονιδιώματα των μολυσμένων ανθρώπινων κυττάρων [ 25 ]. Επιπλέον, η έκφραση της ενδογενούς LINE-1 συχνά αυξάνεται με ιογενή λοίμωξη, συμπεριλαμβανομένης της μόλυνσης από SARS-CoV-2 [ 45 , 46 , 47 ]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η δραστηριότητα ρετρομετάθεσης LINE-1 ρυθμίζεται από το μεταβολισμό του RNA [ 48 , 49 ], την απόκριση βλάβης στο DNA [ 50 ] και την αυτοφαγία [ 51 ]. Η αποτελεσματική ρετρομεταφορά της LINE-1 συχνά σχετίζεται με τη διάσπαση του κυτταρικού κύκλου και του πυρηνικού φακέλου κατά τη διάρκεια της μίτωσης. 52 , 53 ], καθώς και εξωγενείς ρετροϊούς [ 54 , 55 ], που προάγει την είσοδο της LINE-1 στον πυρήνα. Στη μελέτη μας, παρατηρήσαμε αυξημένη κατανομή LINE-1 ORF1p όπως προσδιορίστηκε από την ανοσοϊστοχημεία στον πυρήνα από το BNT162b2 σε όλες τις συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν (0,5, 1 και 2 μg/mL), ενώ LINE-1 ανιχνεύθηκε αυξημένη έκφραση γονιδίου συγκέντρωσης (2 μg/mL). Αξίζει να σημειωθεί ότι η γονιδιακή μεταγραφή ρυθμίζεται από τροποποιήσεις χρωματίνης, ρύθμιση παραγόντων μεταγραφής και ρυθμό αποικοδόμησης RNA, ενώ η μεταφραστική ρύθμιση της πρωτεΐνης περιλαμβάνει στρατολόγηση ριβοσώματος στο κωδικόνιο έναρξης, ρύθμιση επιμήκυνσης πεπτιδίου, τερματισμό της πρωτεϊνικής σύνθεσης ή βιογένεση ριβοσώματος . Αυτές οι δύο διαδικασίες ελέγχονται από διαφορετικούς μηχανισμούς και επομένως μπορεί να μην εμφανίζουν πάντα τα ίδια μοτίβα αλλαγής ως απάντηση σε εξωτερικές προκλήσεις. Η ακριβής ρύθμιση της δραστηριότητας LINE-1 ως απόκριση στο BNT162b2 αξίζει περαιτέρω μελέτη.
Το κυτταρικό μοντέλο που χρησιμοποιήσαμε σε αυτή τη μελέτη είναι μια κυτταρική σειρά καρκινώματος, με ενεργό αντιγραφή DNA που διαφέρει από τα μη διαιρούμενα σωματικά κύτταρα. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι τα κύτταρα Huh7 εμφανίζουν σημαντική διαφορετική έκφραση γονιδίων και πρωτεϊνών συμπεριλαμβανομένων των προς τα πάνω ρυθμιζόμενων πρωτεϊνών που εμπλέκονται στο μεταβολισμό του RNA [ 56 ]. Ωστόσο, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός είναι επίσης ενεργός σε αρκετούς ανθρώπινους ιστούς, όπως ο μυελός των οστών ή οι βασικές στοιβάδες των επιθηλίων, καθώς και κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, και επομένως είναι απαραίτητο να εξεταστεί η επίδραση του BNT162b2 στη γονιδιωματική ακεραιότητα υπό τέτοιες συνθήκες. Επιπλέον, έχει επίσης αναφερθεί αποτελεσματική ρετρομετάθεση της LINE-1 σε μη διαιρούμενα και τερματικά διαφοροποιημένα κύτταρα, όπως οι ανθρώπινοι νευρώνες [ 57 , 58 ].
Η έκθεση αξιολόγησης Pfizer EMA έδειξε επίσης ότι το BNT162b2 κατανέμεται στη σπλήνα (<1,1%), στα επινεφρίδια (<0,1%), καθώς και χαμηλή και μετρήσιμη ραδιενέργεια στις ωοθήκες και τους όρχεις (<0,1%) [ 26 ]. Επιπλέον, δεν υπάρχουν διαθέσιμα δεδομένα σχετικά με τη μεταφορά του BNT162b2 από τον πλακούντα από την έκθεση αξιολόγησης EMA της Pfizer. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το mRNA BNT162b2 εισέρχεται εύκολα στα κύτταρα Huh7 σε συγκέντρωση (0,5 μg/mL) που αντιστοιχεί στο 0,5% της τοπικής συγκέντρωσης στο σημείο της ένεσης, επάγει αλλαγές στο γονίδιο LINE-1 και την έκφραση πρωτεΐνης και εντός 6 ωρών αντίστροφη μεταγραφή του BNT162b2 μπορεί να ανιχνευθεί. Είναι επομένως σημαντικό να διερευνηθεί περαιτέρω η επίδραση του BNT162b2 σε άλλους κυτταρικούς τύπους και ιστούς τόσο in vitro όσο και in vivo.
5. Συμπεράσματα
Η μελέτη μας είναι η πρώτη in vitro μελέτη σχετικά με την επίδραση του εμβολίου mRNA του COVID-19 BNT162b2 στην κυτταρική σειρά ανθρώπινου ήπατος. Παρουσιάζουμε στοιχεία σχετικά με τη γρήγορη είσοδο του BNT162b2 στα κύτταρα και την επακόλουθη ενδοκυτταρική αντίστροφη μεταγραφή του BNT162b2 mRNA στο DNA.
Οι MA, FOF, DY, MB και CL πραγματοποίησαν πειράματα in vitro. Οι MA και FOF πραγματοποίησαν ανάλυση δεδομένων. Η MR και η YDM συνέβαλαν στην υλοποίηση της έρευνας, σχεδίασαν και επέβλεψαν τη μελέτη. Το YDM έγραψε την εργασία με τη συμβολή όλων των συγγραφέων. Όλοι οι συγγραφείς έχουν διαβάσει και έχουν συμφωνήσει με τη δημοσιευμένη έκδοση του χειρογράφου.
Χρηματοδότηση
Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Σουηδικό Ερευνητικό Συμβούλιο, Strategic Research Area Exodiab, Dnr 2009-1039, το Σουηδικό Κυβερνητικό Ταμείο για την Κλινική Έρευνα (ALF) και το ίδρυμα του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Skåne.
Δήλωση του Συμβουλίου Θεσμικής Αναθεώρησης
Δεν εφαρμόζεται.
Δήλωση ενημερωμένης συναίνεσης
Δεν εφαρμόζεται.
Δήλωση διαθεσιμότητας δεδομένων
Όλα τα δεδομένα που υποστηρίζουν τα ευρήματα αυτής της μελέτης είναι διαθέσιμα εντός του άρθρου και των υποστηρικτικών πληροφοριών .
Ευχαριστίες
Οι συγγραφείς ευχαριστούν τους Sven Haidl, Maria Josephson, Enming Zhang, Jia-Yi Li, Caroline Haikal και Pradeep Bompada για την υποστήριξή τους σε αυτή τη μελέτη.
Συγκρούσεις συμφερόντων
Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων.
βιβλιογραφικές αναφορές
Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας. Πίνακας ελέγχου Coronavirus (COVID-19). Διαθέσιμο στο διαδίκτυο: https://covid19.who.int/ (πρόσβαση στις 22 Φεβρουαρίου 2022).
Walsh, ΕΕ; Frenck, RW, Jr. Falsey, AR; Kitchin, Ν.; Absalon, J.; Gurtman, Α.; Lockhart, S.; Neuzil, Κ.; Mulligan, MJ; Bailey, R.; et al. Ασφάλεια και ανοσογονικότητα δύο υποψηφίων εμβολίων COVID-19 με βάση το RNA. N. Engl. J. Med. 2020 , 383 , 2439–2450. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Polack, FP; Thomas, SJ; Kitchin, Ν.; Absalon, J.; Gurtman, Α.; Lockhart, S.; Perez, JL; Perez Marc, G.; Moreira, ED; Zerbini, C.; et al. Ασφάλεια και αποτελεσματικότητα του εμβολίου BNT162b2 mRNA COVID-19. N. Engl. J. Med. 2020 , 383 , 2603–2615. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Harris, RJ; Hall, JA; Zaidi, Α.; Andrews, NJ; Dunbar, JK; Dabrera, G. Επίδραση του εμβολιασμού στην οικιακή μετάδοση του SARS-CoV-2 στην Αγγλία. N. Engl. J. Med. 2021 , 385 , 759–760. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Butt, AA; Omer, SB; Yan, Ρ.; Shaikh, OS; Mayr, FB SARS-CoV-2 εμβόλιο αποτελεσματικότητα σε εθνικό πληθυσμό υψηλού κινδύνου σε πραγματικό κόσμο. Αννα. Κρατώ. Med. 2021 , 174 , 1404–1408. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Dagan, Ν.; Barda, Ν.; Kepten, Ε.; Miron, Ο.; Perchik, S.; Katz, MA; Hernan, MA; Lipsitch, Μ.; Reis, Β.; Εμβόλιο Balicer, RD BNT162b2 mRNA Covid-19 σε πλαίσιο μαζικού εμβολιασμού σε εθνικό επίπεδο. N. Engl. J. Med. 2021 , 384 , 1412–1423. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Rossman, Η.; Shilo, S.; Meir, Τ.; Gorfine, Μ.; Shalit, U.; Segal, E. Η δυναμική του COVID-19 μετά από ένα εθνικό πρόγραμμα εμβολιασμού στο Ισραήλ. Nat. Med. 2021 , 27 , 1055–1061. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Ανεμιστήρας, BE; Shen, JY; Lim, XR; Tu, TM; Chang, CCR; Khin, HSW; Koh, JS; Rao, JP; Lau, SL; Tan, GB; et al. Εγκεφαλική φλεβική θρόμβωση μετά τον εμβολιασμό BNT162b2 mRNA SARS-CoV-2: Ένα συμβάν μαύρου κύκνου. Είμαι. J. Hematol. 2021 , 96 , E357–E361. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Larson, KF; Ammirati, Ε.; Adler, ED; Cooper, LT, Jr. Hong, KN; Saponara, G.; Couri, D.; Cereda, Α.; Procopio, Α.; Cavalotti, C.; et al. Μυοκαρδίτιδα Μετά από Εμβολιασμό BNT162b2 και mRNA-1273. Κυκλοφορία 2021 , 144 , 506–508. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Menni, C.; Klaser, Κ.; May, Α.; Polidori, L.; Capdevila, J.; Louca, Ρ.; Sudre, CH; Nguyen, LH; Drew, DA; Merino, J.; et al. Παρενέργειες εμβολίου και μόλυνση από SARS-CoV-2 μετά τον εμβολιασμό σε χρήστες της εφαρμογής COVID Symptom Study στο Ηνωμένο Βασίλειο: Μια προοπτική μελέτη παρατήρησης. Lancet Infect. Dis. 2021 , 21 , 939–949. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Hansen, Τ.; Titze, U.; Kulamadayil-Heidenreich, NSA; Glombitza, S.; Tebbe, JJ; Rocken, C.; Schulz, Β.; Weise, Μ.; Wilkens, L. Πρώτη περίπτωση μεταθανάτιας μελέτης σε ασθενή που εμβολιάστηκε κατά του SARS-CoV-2. Int. J. Infect. Dis. 2021 , 107 , 172–175. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Kadali, RAK; Janagama, R.; Peruru, S.; Malayala, SV Παρενέργειες του εμβολίου BNT162b2 mRNA COVID-19: Μια τυχαιοποιημένη, συγχρονική μελέτη με λεπτομερή αυτοαναφερόμενα συμπτώματα από εργαζόμενους στον τομέα της υγείας. Int. J. Infect. Dis. 2021 , 106 , 376–381. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Mazzatenta, C.; Piccolo, V.; Pace, G.; Romano, Ι.; Argenziano, G.; Bassi, A. Πορφυρικές βλάβες στα βλέφαρα που αναπτύχθηκαν μετά το εμβόλιο BNT162b2 mRNA COVID-19: Ένα άλλο κομμάτι του παζλ δέρματος SARS-CoV-2; J. Eur. Ακαδ. Dermatol. Venereol. 2021 , 35 , e543–e545. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Lee, EJ; Cines, DB; Gernsheimer, Τ.; Kessler, C.; Michel, Μ.; Tarantino, MD; Semple, JW; Arnold, DM; Godeau, Β.; Lambert, βουλευτής; et al. Θρομβοπενία μετά από εμβολιασμό Pfizer και Moderna SARS-CoV-2. Είμαι. J. Hematol. 2021 , 96 , 534–537. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Ishay, Υ.; Kenig, Α.; Tsemach-Toren, Τ.; Amer, R.; Rubin, L.; Hershkovitz, Υ.; Kharouf, F. Αυτοάνοσα φαινόμενα μετά τον εμβολιασμό SARS-CoV-2. Int. Immunopharmacol. 2021 , 99 , 107970. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Das, BB; Kohli, U.; Ramachandran, Ρ.; Nguyen, HH; Greil, G.; Hussain, Τ.; Tandon, Α.; Kane, C.; Avula, S.; Duru, C.; et al. Μυοπερικαρδίτιδα μετά από εμβολιασμό με mRNA COVID-19 σε Εφήβους 12 έως 18 ετών. J. Pediatr. 2021 , 238 , 26–32.e1. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
McLaurin-Jiang, S.; Garner, CD; Krutsch, Κ.; Hale, TW Συμπτώματα μητέρας και παιδιού μετά τον εμβολιασμό κατά του COVID-19 μεταξύ μητέρων που θηλάζουν. Θηλάστε. Med. 2021 , 16 , 702–709. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Barda, Ν.; Dagan, Ν.; Ben-Shlomo, Υ.; Kepten, Ε.; Waxman, J.; Ohana, R.; Hernan, MA; Lipsitch, Μ.; Kohane, Ι.; Netzer, D.; et al. Ασφάλεια του εμβολίου BNT162b2 mRNA Covid-19 σε πανελλαδικό περιβάλλον. N. Engl. J. Med. 2021 , 385 , 1078–1090. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Baden, LR; El Sahly, HM; Essink, Β.; Kotloff, Κ.; Frey, S.; Novak, R.; Diemert, D.; Spector, SA; Rouphael, Ν.; Creech, CB; et al. Αποτελεσματικότητα και ασφάλεια του εμβολίου mRNA-1273 SARS-CoV-2. N. Engl. J. Med. 2021 , 384 , 403–416. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Sadoff, J.; Gray, G.; Vandebosch, Α.; Cardenas, V.; Shukarev, G.; Grinsztejn, Β.; Goepfert, PA; Truyers, C.; Fennema, Η.; Spiessens, Β.; et al. Ασφάλεια και αποτελεσματικότητα του εμβολίου μίας δόσης Ad26.COV2.S κατά του Covid-19. N. Engl. J. Med. 2021 , 384 , 2187–2201. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Eichinger, S.; Warkentin, TE; Greinacher, Α. Θρομβωτική Θρομβοπενία μετά από Εμβολιασμό ChAdOx1 nCoV-19. Απάντηση. N. Engl. J. Med. 2021 , 385 , e11. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Δωροφέτη, Β.; Ciobica, Α.; Ilie, OD; Maftei, R.; Ilea, C. Mini-Review Discusing the Reliability and Efficiency of COVID-19 Vaccines. Diagnostics 2021 , 11 , 579. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Zhang, L.; Richards, Α.; Barrasa, MI; Hughes, SH; Young, RA; Jaenisch, R. Το αντίστροφο μεταγραφόμενο SARS-CoV-2 RNA μπορεί να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα καλλιεργημένων ανθρώπινων κυττάρων και μπορεί να εκφραστεί σε ιστούς που προέρχονται από ασθενείς. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. ΗΠΑ 2021 , 118 , e2105968118. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Tanaka, Η.; Takata, Ν.; Sakurai, Υ.; Yoshida, Τ.; Inoue, Τ.; Tamagawa, S.; Nakai, Υ.; Tange, Κ.; Yoshioka, Η.; Maeki, Μ.; et al. Παράδοση ολιγονουκλεοτιδίων με χρήση αυτοδιασπώμενου υλικού που μοιάζει με λιπίδιο. Pharmaceutics 2021 , 13 , 544. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Sedic, Μ.; Senn, JJ; Lynn, Α.; Laska, Μ.; Smith, Μ.; Platz, SJ; Bolen, J.; Hoge, S.; Bulychev, Α.; Jacquinet, Ε.; et al. Αξιολόγηση Ασφάλειας Τροποποιημένου mRNA που έχει διαμορφωθεί με νανοσωματίδια λιπιδίων στον αρουραίο Sprague-Dawley και τον πίθηκο Cynomolgus. Κτηνίατρος. Pathol. 2018 , 55 , 341–354. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Sato, Υ.; Matsui, Η.; Yamamoto, Ν.; Sato, R.; Munakata, Τ.; Kohara, Μ.; Harashima, H. Η εξαιρετικά ειδική παράδοση του siRNA σε ηπατοκύτταρα παρακάμπτει την τοξικότητα που σχετίζεται με τα νανοσωματίδια λιπιδίων με τη μεσολάβηση των ενδοθηλιακών κυττάρων που οδηγεί στην ασφαλή και αποτελεσματική μείωση του ιού της ηπατίτιδας Β. J. Control. Έκδοση 2017 , 266 , 216–225. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Heidel, JD; Yu, Ζ.; Liu, JY; Rele, SM; Liang, Υ.; Zeidan, RK; Kornbrust, DJ; Davis, ME Χορήγηση σε πρωτεύοντα πλην του ανθρώπου κλιμακούμενες ενδοφλέβιες δόσεις στοχευμένων νανοσωματιδίων που περιέχουν υπομονάδα M2 siRNA της ριβονουκλεοτιδικής αναγωγάσης. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. ΗΠΑ 2007 , 104 , 5715–5721. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Gallud, Α.; Munson, MJ; Liu, Κ.; Idstrom, Α.; Barriga, HM; Tabaei, S.; Aliakbarinodehi, N.; Ojansivu, Μ.; Lubart, Q.; Doutch, JJ; et al. Η χρονική εξέλιξη της αποβολής PEG και της στέψης της πρωτεΐνης ορού καθορίζει την κινητική της κυτταρικής πρόσληψης και την παροχή των νανοσωματιδίων λιπιδίων. bioRxiv 2021 . [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Mita, Ρ.; Wudzinska, Α.; Sun, X.; Andrade, J.; Nayak, S.; Kahler, DJ; Badri, S.; LaCava, J.; Ueberheide, Β.; Yun, CY; et al. Εντοπισμός πρωτεΐνης LINE-1 και λειτουργική δυναμική κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Elife 2018 , 7 , e30058. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Sato, Υ.; Kinami, Υ.; Hashiba, Κ.; Harashima, H. Διαφορετικές κινητικές για την ηπατική πρόσληψη νανοσωματιδίων λιπιδίων μεταξύ του υποδοχέα απολιποπρωτεΐνης Ε/λιποπρωτεΐνης χαμηλής πυκνότητας και της οδού υποδοχέα Ν-ακετυλο-d-γαλακτοζαμίνης/ασιαλογλυκοπρωτεΐνης. J. Control. Έκδοση 2020 , 322 , 217–226. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Vogel, ΑΒ; Kanevsky, Ι.; Che, Υ.; Swanson, KA; Muik, Α.; Vormehr, Μ.; Kranz, LM; Walzer, KC; Hein, S.; Guler, Α.; et al. Τα εμβόλια BNT162b προστατεύουν τους μακάκους ρέζους από τον SARS-CoV-2. Nature 2021 , 592 , 283–289. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Bahl, Κ.; Senn, JJ; Yuzhakov, Ο.; Bulychev, Α.; Brito, LA; Hassett, KJ; Λάσκα, ΕΓΩ; Smith, Μ.; Almarsson, Ο.; Thompson, J.; et al. Προκλινική και κλινική επίδειξη ανοσογονικότητας από εμβόλια mRNA κατά των ιών της γρίπης H10N8 και H7N9. ΜοΙ. Εκεί. 2017 , 25 , 1316–1327. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Bril, F.; Al Diffalha, S.; Dean, Μ.; Fettig, DM Αυτοάνοση ηπατίτιδα που αναπτύσσεται μετά από εμβόλιο για τη νόσο του κορωνοϊού 2019 (COVID-19): Αιτία ή θύμα; J. Hepatol. 2021 , 75 , 222–224. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Kazazian, HH, Jr.; Moran, JV Mobile DNA in Health and Disease. N. Engl. J. Med. 2017 , 377 , 361–370. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Coffin, JM; Fan, Η. The Discovery of Reverse Transcriptase. Annu. Rev. Virol. 2016 , 3 , 29–51. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Ostertag, EM; Goodier, JL; Zhang, Υ.; Τα στοιχεία Kazazian, HH, Jr. SVA είναι μη αυτόνομα ρετροτρανσποζόνια που προκαλούν ασθένεια στους ανθρώπους. Είμαι. J. Hum. Genet. 2003 , 73 , 1444–1451. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Hancks, DC; Kazazian, HH, Jr. Ενεργά ανθρώπινα ρετροτρανσποζόνια: Παραλλαγή και ασθένεια. Curr. Γνώμη. Genet. Dev. 2012 , 22 , 191–203. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Jones, RB; Song, H.; Xu, Υ.; Garrison, KE; Buzdin, AA; Anwar, Ν.; Hunter, DV; Mujib, S.; Mihajlovic, V.; Martin, Ε.; et al. Το DNA του ρετρομεταβιβάσιμου στοιχείου LINE-1 συσσωρεύεται σε κύτταρα μολυσμένα με HIV-1. J. Virol. 2013 , 87 , 13307–13320. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Macchietto, MG; Langlois, RA; Shen, επαγόμενη από τον ιό SS μετατιθέμενη προς τα πάνω ρύθμιση έκφρασης στοιχείων σε κύτταρα ξενιστές ανθρώπου και ποντικού. Life Sci. Συμμαχία 2020 , 3 , e201900536. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Γιν, Υ.; Liu, XZ; Αυτός, Χ.; Zhou, LQ Ο εξωγενής κορωνοϊός αλληλεπιδρά με το ενδογενές ρετροτρανσποζόνιο σε ανθρώπινα κύτταρα. Εμπρός. Cell Infect. Microbiol. 2021 , 11 , 609160. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Belancio, αντιπρόεδρος; Roy-Engel, AM; Deininger, P. Η επίδραση των πολλαπλών θέσεων ματίσματος σε ανθρώπινα στοιχεία L1. Gene 2008 , 411 , 38-45. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Dai, L.; Taylor, MS; O’Donnell, KA; Η πρωτεΐνη C1 που δεσμεύει το Boeke, JD Poly(A) είναι απαραίτητη για την αποτελεσματική ρετρομεταφορά του L1 και επηρεάζει το σχηματισμό του L1 RNP. ΜοΙ. Cell Biol. 2012 , 32 , 4323–4336. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Guo, Η.; Chitiprolu, Μ.; Gagnon, D.; Meng, L.; Perez-Iratxeta, C.; Lagace, D.; Gibbings, D. Αυτοφαγία υποστηρίζει τη γονιδιωματική σταθερότητα αποικοδομώντας το RNA ρετροτρανσποζονίου. Nat. Commun. 2014 , 5 , 5276. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Xie, Υ.; Mates, L.; Ivics, Ζ.; Izsvak, Ζ.; Martin, SL; Μια κυτταρική διαίρεση W. προάγει την αποτελεσματική ρετρομεταφορά σε μια σταθερή κυτταρική σειρά αναφοράς L1. Οχλος. DNA 2013 , 4 , 10. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Shi, Χ.; Seluanov, Α.; Gorbunova, V. Απαιτούνται κυτταρικές διαιρέσεις για ρετρομεταφορά L1. ΜοΙ. Cell Biol. 2007 , 27 , 1264–1270. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Goff, SP Παράγοντες υποδοχής που εκμεταλλεύονται οι ρετροϊοί. Nat. Rev. Microbiol 2007 , 5 , 253-263. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Suzuki, Υ.; Craigie, R. Ο δρόμος προς τη χρωματίνη – Πυρηνική είσοδος ρετροϊών. Nat. Rev. Microbiol. 2007 , 5 , 187–196. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Shi, J.; Wang, X.; Lyu, L.; Jiang, Η.; Zhu, HJ Σύγκριση έκφρασης πρωτεΐνης μεταξύ ανθρώπινων ήπατων και ηπατικών κυτταρικών σειρών HepG2, Hep3B και Huh7 με χρήση πρωτεομικών SWATH και MRM-HR: Εστιάζοντας στα ένζυμα που μεταβολίζουν τα φάρμακα. Drug Metab. Φαρμακοκινητική. 2018 , 33 , 133–140. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Kubo, S.; Seleme, MC; Soifer, HS; Perez, JL; Moran, JV; Kazazian, HH, Jr.; Kasahara, N. L1 ρετρομετάθεση σε μη διαιρούμενα και πρωτογενή ανθρώπινα σωματικά κύτταρα. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. ΗΠΑ 2006 , 103 , 8036–8041. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Macia, Α.; Widmann, TJ; Heras, SR; Ayllon, V.; Sanchez, L.; Benkaddour-Boumzaouad, M.; Munoz-Lopez, Μ.; Rubio, Α.; Amador-Cubero, S.; Blanco-Jimenez, Ε.; et al. Σχεδιασμένη ρετρομετάθεση LINE-1 σε μη διαιρούμενους ανθρώπινους νευρώνες. Genome Res. 2017 , 27 , 335–348. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Publisher’s Note: MDPI stays neutral with regard to jurisdictiona
Preclinical studies of COVID-19 mRNA vaccine BNT162b2, developed by Pfizer and BioNTech, showed reversible hepatic effects in animals that received the BNT162b2 injection. Furthermore, a recent study showed that SARS-CoV-2 RNA can be reverse-transcribed and integrated into the genome of human cells. In this study, we investigated the effect of BNT162b2 on the human liver cell line Huh7 in vitro. Huh7 cells were exposed to BNT162b2, and quantitative PCR was performed on RNA extracted from the cells. We detected high levels of BNT162b2 in Huh7 cells and changes in gene expression of long interspersed nuclear element-1 (LINE-1), which is an endogenous reverse transcriptase. Immunohistochemistry using antibody binding to LINE-1 open reading frame-1 RNA-binding protein (ORFp1) on Huh7 cells treated with BNT162b2 indicated increased nucleus distribution of LINE-1. PCR on genomic DNA of Huh7 cells exposed to BNT162b2 amplified the DNA sequence unique to BNT162b2. Our results indicate a fast up-take of BNT162b2 into human liver cell line Huh7, leading to changes in LINE-1 expression and distribution. We also show that BNT162b2 mRNA is reverse transcribed intracellularly into DNA in as fast as 6 h upon BNT162b2 exposure. View Full-Text
This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited
Aldén, M.; Olofsson Falla, F.; Yang, D.; Barghouth, M.; Luan, C.; Rasmussen, M.; De Marinis, Y. Intracellular Reverse Transcription of Pfizer BioNTech COVID-19 mRNA Vaccine BNT162b2 In Vitro in Human Liver Cell Line. Curr. Issues Mol. Biol.2022, 44, 1115-1126. https://doi.org/10.3390/cimb44030073
AMA Style
Aldén M, Olofsson Falla F, Yang D, Barghouth M, Luan C, Rasmussen M, De Marinis Y. Intracellular Reverse Transcription of Pfizer BioNTech COVID-19 mRNA Vaccine BNT162b2 In Vitro in Human Liver Cell Line. Current Issues in Molecular Biology. 2022; 44(3):1115-1126. https://doi.org/10.3390/cimb44030073Chicago/Turabian Style
Aldén, Markus, Francisko Olofsson Falla, Daowei Yang, Mohammad Barghouth, Cheng Luan, Magnus Rasmussen, and Yang De Marinis. 2022. “Intracellular Reverse Transcription of Pfizer BioNTech COVID-19 mRNA Vaccine BNT162b2 In Vitro in Human Liver Cell Line” Current Issues in Molecular Biology 44, no. 3: 1115-1126. https://doi.org/10.3390/cimb44030073
Λήψη: 18 Ιανουαρίου 2022 / Αναθεώρηση: 19 Φεβρουαρίου 2022 / Αποδοχή: 23 Φεβρουαρίου 2022 / Δημοσίευση: 25 Φεβρουαρίου 2022
(Αυτό το άρθρο ανήκει στο Θέμα Κλινική, Μεταφραστική και Βασική Έρευνα για τις ασθένειες του ήπατος)
Προβολή πλήρους κειμένου Λήψη PDF Αναζήτηση Φιγούρων
Εξαγωγή αναφοράς
Αφηρημένη
Οι προκλινικές μελέτες του εμβολίου mRNA του COVID-19 BNT162b2, που αναπτύχθηκε από την Pfizer και τη BioNTech, έδειξαν αναστρέψιμες ηπατικές επιδράσεις σε ζώα που έλαβαν την ένεση BNT162b2. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι το RNA του SARS-CoV-2 μπορεί να αντιστραφεί και να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα των ανθρώπινων κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την επίδραση του BNT162b2 στην κυτταρική σειρά ανθρώπινου ήπατος Huh7 in vitro. Τα κύτταρα Huh7 εκτέθηκαν σε BNT162b2 και πραγματοποιήθηκε ποσοτική PCR σε RNA που εκχυλίστηκε από τα κύτταρα. Ανιχνεύσαμε υψηλά επίπεδα BNT162b2 σε κύτταρα Huh7 και αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση του μακράς διάσπαρτου πυρηνικού στοιχείου-1 (LINE-1), που είναι μια ενδογενής αντίστροφη μεταγραφάση. Η ανοσοϊστοχημεία που χρησιμοποιεί δέσμευση αντισώματος με LINE-1 ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης-1 πρωτεΐνη δέσμευσης RNA (ORFp1) σε κύτταρα Huh7 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με BNT162b2 έδειξε αυξημένη κατανομή πυρήνα της LINE-1. Η PCR σε γονιδιωματικό DNA κυττάρων Huh7 που εκτέθηκαν σε BNT162b2 ενίσχυσε την αλληλουχία DNA μοναδική για το BNT162b2. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν γρήγορη πρόσληψη του BNT162b2 στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά του ήπατος Huh7, που οδηγεί σε αλλαγές στην έκφραση και κατανομή της LINE-1. Δείχνουμε επίσης ότι το mRNA του BNT162b2 μεταγράφεται αντίστροφα ενδοκυτταρικά στο DNA σε μόλις 6 ώρες μετά την έκθεση στο BNT162b2. Προβολή πλήρους κειμένου
Αυτό είναι ένα άρθρο ανοιχτής πρόσβασης που διανέμεται υπό την άδεια Creative Commons Attribution License και επιτρέπει την απεριόριστη χρήση, διανομή και αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, υπό την προϋπόθεση ότι το πρωτότυπο έργο αναφέρεται σωστά
Aldén, Μ.; Olofsson Falla, F.; Yang, D.; Barghouth, Μ.; Luan, C.; Rasmussen, Μ.; De Marinis, Y. Ενδοκυτταρική αντίστροφη μεταγραφή του Pfizer BioNTech COVID-19 mRNA Vaccine BNT162b2 In vitro σε κυτταρική σειρά ανθρώπινου ήπατος. Curr. Θέματα Μολ. Biol. 2022, 44, 1115-1126. https://doi.org/10.3390/cimb44030073
Στυλ AMA
Aldén M, Olofsson Falla F, Yang D, Barghouth M, Luan C, Rasmussen M, De Marinis Y. Intracellular Reverse Transcription of Pfizer BioNTech COVID-19 mRNA Vaccine BNT162b2 In vitro in Human Liver Cell Line. Επίκαιρα Θέματα Μοριακής Βιολογίας. 2022; 44(3):1115-1126. https://doi.org/10.3390/cimb44030073
Aldén, Markus, Francisko Olofsson Falla, Daowei Yang, Mohammad Barghouth, Cheng Luan, Magnus Rasmussen και Yang De Marinis. 2022. “Intracellular Reverse Transcription of Pfizer BioNTech COVID-19 mRNA Vaccine BNT162b2 In vitro in Human Liver Cell Line” Current Issues in Molecular Biology 44, αρ. 3: 1115-1126. https://doi.org/10.3390/cimb44030073
«Χείμαρρος» κατά της Δύσης ο Σέρβος πρόεδρος για το «μπλοκάρισμα» των ρωσικών ΜΜΕ στην Ευρώπη
Ο πρόεδρος της Σερβίας Αλεξάνταρ Βούτσιτς σχολίασε το «μπλόκο» που έχει εφαρμοστεί στο Sputnik και στο RT στην Ευρώπη, κάνοντας λόγο για «απαγόρευση κάθε μέσου που μιλά διαφορετικά» προσθέτοντας πως «θέλουν να μας βάλουν σε στρατόπεδο όσους σκεφτόμαστε διαφορετικά»!
Επί της ουσίας ο Σέρβος πρόεδρος δείχνει πως έχει πάρει την απόφασή του να μην στραφεί κατά της Ρωσίας και κατηγορεί πλέον τη Δύση ως καθεστώς ανελευθερίας.
Ούτε λίγο ούτε πολύ ο Σέρβος πρόεδρος κατηγορεί τη Δύση ότι την ελευθερία του λόγου την αποδέχεται μόνο εάν αυτά που λέγονται συμφωνούν με αυτά που η ίδια υποστηρίζει.
Δηλαδή, καταγγέλλει την Δύση ότι έχει έλλειμμα δημοκρατίας, κάτι εντελώς αντίθετο από αυτό που περηφανεύεται, καθώς όπως όλοι ξέρουμε διεκδικεί το πρωτάθλημα «δημοκρατικότητας» από τον Β’ ΠΠ και μετά.
Μόνο που ζούμε σε μία εποχή που οι λέξεις έχουν χάσει το νόημά τους ακριβώς όπως είχε συμβεί και επί Πελοποννησιακού Πολέμου τον καιρό του Θουκυδίδη.
«Κάποιοι από αυτούς θέλουν να μας βάλουν όλους όσους σκεφτόμαστε διαφορετικά σε στρατόπεδο, θα απαγόρευαν κάθε μέσο που μιλά διαφορετικά.
Όταν λένε ότι χρειάζεται ελευθερία του Τύπου θεωρούν ότι αυτή η ελευθερία είναι μόνο για εκείνους ώστε να υπάρχουν μόνο αυτοί.
Ο κόσμος τα βλέπει όλα αυτά, έχουν μία ευκαιρία στις 3 Απριλίου (σ.σ. εκλογές στην Σερβία), ας δούμε τι θα επικρατήσει, η ομοφωνία τους ή η έντιμη δημοκρατική Σερβία».
Νωρίτερα το YouTube μπλόκαρε τα κανάλια που συνδέονται με τα δίκτυα Sputnik και RT στην Ευρώπη με «άμεση ισχύ» ενώ το Τwitter ανέφερε ότι ξεκινά να «μαρκάρει»(!) τους λογαριασμούς εργαζομένων του Sputnik, με το πρακτορείο να απαντά ότι πρόκειται για «κυνήγι μαγισσών».
Κι όλα αυτά στο όνομα της… ελευθερίας. Η βασική αρχή της ελευθερίας, είναι η ελευθερία του Λόγου.
Ο Μπάϊντεν απειλεί να κατασχέσει ακόμη και τα ιδιωτικά γιοτ των ολιγαρχών της Ρωσίας υπό τα θερμά χειροκροτήματα των εκπροσώπων του Κογκρέσου. Πιστεύει κανείς ότι αυτοί θα αντισταθούν να εγκρίνουν έναν πόλεμο που θα οδηγήσει τον πλανήτη σε ΠΥΡΗΝΙΚΟ ΟΛΟΚΑΥΤΩΜΑ;;;
Ρώσος ΥΠΕΞ Σ.Λαβρόφ: «Πρέπει να ξέρουν όλοι ότι ο Τρίτος Παγκόσμιος Πόλεμος θα είναι πυρηνικός και καταστροφικός»
«Οι Ουκρανοί παίζουν με τον χρόνο, μετά από εντολή των ΗΠΑ»
Ο υπουργός Εξωτερικών της Ρωσίας, Σεργκέι Λαβρόφ, προειδοποίησε την Δύση πως υπάρχει μεγάλη πιθανότητα ενός τρίτου Παγκοσμίου Πολέμου ο οποίος θα είναι πυρηνικός και καταστροφικός.
Ένας Γ’ ΠΠ σημαίνει πως ρωσικές και ΝΑΤΟϊκές και άρα αμερικανικές δυνάμεις θα συγκρουστούν απευθείας μεταξύ τους, χωρίς δηλαδή την παρέμβαση «αντιπροσώπων» και αυτές οι συγκρούσεις θα οδηγήσουν σε πυρηνικό ολοκαύτωμα.
Για άλλη μία φορά ανώτατος Ρώσος αξιωματούχος επαναφέρει το ζήτημα πιθανής χρήσης πυρηνικών όπλων εάν τα πράγματα συνεχίσουν να οδεύουν προς κλιμάκωση.
«Ένας τρίτος Παγκόσμιος Πόλεμος θα ήταν πυρηνικός και καταστροφικός» είπε, ειδικότερα, ο επικεφαλής της ρωσικής διπλωματίας.
Η Ρωσία στο επίσημο πυρηνικό της δόγμα θεωρεί εκ των ουκ άνευ την χρήση πυρηνικών όπλων στην περίπτωση που υπάρξει απειλή για την εθνική της υπόσταση.
Οι κυρώσεις οι οποίες επιβάλλονται εναντίον της έχουν ως στόχο ακριβώς αυτό (το αν το πετύχουν ή όχι είναι άλλο ζήτημα).
Ο ίδιος επανάλαβε πως η χώρα του δεν θα επιτρέψει στην Ουκρανία να αποκτήσει πυρηνικά όπλα.
Όσον αφορά στην πορεία των διαπραγματεύσεων των δύο πλευρών, ο Λαβρόφ επεσήμανε πως η Ρωσία είναι έτοιμη για νέο γύρο σήμερα, αλλά οι Ουκρανοί παίζουν με τον χρόνο, μετά από εντολή των ΗΠΑ.
Παράλληλα, σε άλλο σημείο είπε ότι η Ρωσία έχει «πολλούς φίλους» και δεν γίνεται να απομονωθεί.
«Ήμασταν έτοιμοι για κυρώσεις αλλά δεν περιμέναμε να στοχεύσουν αθλητές και δημοσιογράφους»
Αναφερόμενος στις κυρώσεις κατά της Ρωσίας, ο Λαβρόφ ανέφερε πως η χώρα «ήταν έτοιμη για κυρώσεις, αλλά δεν περίμενε να στοχεύσουν αθλητές, δημοσιογράφους και εκπροσώπους του πολιτιστικού χώρου».
Νωρίτερα, για το ίδιο ζήτημα, ο εκπρόσωπος του Κρεμλίνου ξεκαθάρισε ότι θα πρέπει να υπάρξει απάντηση, αλλά αυτή δεν πρέπει να προκαλέσει ζημία στη Ρωσία.
Σ.γ.: Θα φτάσουμε δηλαδή σε τέτοιο σημείο αυτοαλλοτρίωσης ώστε να δεχθούμε και να ευχόμαστε τον Τρίτο Παγκόσμιο Πόλεμο σαν την αρμόζουσα τιμωρία για τις ατέλειωτες παρεκτροπές μας και την αμετανοησία μας. Θα έλεγα έχουμε κατανοήσει τι σημαίνει αμετανοησία και παραβίαση του Ηθικού Νόμου;
Μια ΕΞΑΙΡΕΤΙΚΗ συνέντευξη στον JD Rucker!Ο Dr. Vladimir Zelenko έχει δώσει πολλές συνεντεύξεις σχετικά με την επιστήμη πίσω από το Covid-19, τις θεραπείες και τα λεγόμενα «εμβόλια». Αλλά σε αυτή τη συνέντευξη, πήγαμε σε ένα πνευματικό και συνωμοτικό μονοπάτι.
Υπάρχουν λόγοι να ανησυχούμε, αλλά τελικά υπάρχει ένας τεράστιος λόγος να ελπίζουμε. Αυτό είναι το γενικότερο μήνυμα του Δρ Vladimir «Zev» Zelenko στην τελευταία μου συνέντευξη για το The Midnight Sentinel. Καλύψαμε πολύ περισσότερα από αυτό και το σύνολο της συνέντευξης είναι συναρπαστικό. Συνιστώ ανεπιφύλακτα να αφιερώσετε χρόνο για να την ακούσετε ολόκληρη.
Για λόγους πλήρους διαφάνειας, η Z-Stack είναι μια εταιρεία που πωλεί τα διατροφικά προϊόντα του Δρ Zelenko και είναι ένας από τους κορυφαίους χορηγούς μας. Αλλά εδώ είναι το θέμα. Ήλπιζα να φέρω τον Δρ. Ζελένκο στην εκπομπή μου από πολύ πριν η Z-Stack γίνει χορηγός μας. Αν δεν είχαν γίνει ποτέ χορηγός, θα εξακολουθούσα να έχω πραγματοποιήσει αυτή τη συνέντευξη και τίποτα δεν θα είχε αλλάξει. Το αστείο είναι ότι επικοινωνήσαμε πρώτοι για να τον φέρουμε στην εκπομπή, και κατά τη διάρκεια των συνομιλιών μας ο εκπρόσωπος του Dr. Zelenko μου μίλησε για την Z-Stack. Ασχολούμαι με κάθε συστατικό ξεχωριστά, ώστε να μην επηρεάζεται ο σχολιασμός.
Περίπου στα μισά της συνέντευξης, ζήτησα από τον Δρ Ζελένκο να περιγράψει το τελικό παιχνίδι. Είχαμε μιλήσει για το τι συνέβαινε. Τώρα, ήθελα να μάθω το γιατί, και ο Δρ Ζελένκο έριξε βόμβες…
«Το καλό θα κερδίσει. Ο Θεός θα νικήσει. Το μόνο μεταβλητό εδώ είναι ο αριθμός των νεκρών. Και αυτό που πραγματικά πιστεύω ότι συμβαίνει είναι ότι ο κόσμος έχει πραγματικά διολισθήσει σε κάτι που, υποθέτω, θα μπορούσε να συγκριθεί με τα Σόδομα και τα Γόμορρα στη Βίβλο. Ακολασία, ανηθικότητα, η ιερότητα του γάμου αποδεκατίζεται, οι ρόλοι των δύο φύλων, οι αμβλώσεις, οι παιδικές θυσίες, βασικά η λατρεία ψεύτικων θεών. Και νομίζω ότι για μένα είναι σαν να βρισκόμαστε στη γενιά του κατακλυσμού και τα νερά ανεβαίνουν και ο Θεός μας δίνει την ευκαιρία να μπούμε στην κιβωτό και να σωθούμε ή να πνιγούμε στα ταραγμένα νερά. Ο κόσμος θα καθαρίσει και η τελική επιλογή είναι: «Σε ποιον θα υποκλιθείτε; Θα υποκλιθείτε στον Δημιουργό που μας δημιουργεί κάθε στιγμή στον χρόνο, που μας αγαπά, που μας δίνει δύναμη, αποφασιστικότητα, συνείδηση, ελεύθερη βούληση; Ή θα υποκλιθείτε στους κοινωνιοπαθείς (antisocial, psychopathic) ολιγάρχες και τις διεφθαρμένες κυβερνήσεις; Λοιπόν, ας δούμε πώς θα εξελιχθεί αυτό.
Είναι λοιπόν μια επιλογή που δίνεται σε κάθε ανθρώπινο ον. Αυτό είναι – αυτό που λέγατε ότι υπάρχουν ευλογίες εδώ – αυτή είναι η κρυμμένη ευλογία επειδή εμείς ως κοινωνία, ως κόσμος, λατρέψαμε κάθε θεό εκτός από τον αληθινό Θεό. Τον θεό της επιστήμης, τον θεό της τεχνολογίας, τον θεό του χρήματος, τον θεό της φήμης, τον θεό της εξουσίας.
Και έτσι έχουμε εναποθέσει την πίστη μας στα έργα του ανθρώπου και όχι στον Πανταχού Παρόντα, Πανταχού Παρόντα δημιουργό που ζωογονεί τη δημιουργία κάθε στιγμή του χρόνου. Και το εννοώ αυτό γιατί δημιούργησε εσένα και εμένα. Πρόκειται λοιπόν για μια ενεργή δυναμική διαδικασία. Με αυτόν τον τρόπο, παρεμπιπτόντως, αντιμετωπίζω το άγχος, διότι το άγχος ζει στον ψυχολογικό χώρο όπου η συνείδηση του Θεού απουσιάζει.
Και έτσι, αν πιστεύω ότι ο Θεός είναι μέσα μου και γύρω μου και συμμετέχει ενεργά στη δημιουργία μου, τότε δεν είμαι μόνος. Και αν δεν είμαι μόνος, δεν πρόκειται να έχω άγχος. Τέλος πάντων, αυτό είναι το θεολογικό μου σχόλιο».
Φαίνεται όλο και περισσότερο τους τελευταίους δύο μήνες ότι οι γιατροί με τους οποίους μιλάω σχετικά με το Covid, τα εμβόλια και την παγκοσμιοποιητική ατζέντα αποδεικνύονται πνευματικοί στην κοσμοθεωρία τους. Στην πραγματικότητα, η συντριπτική πλειονότητα των ανθρώπων με τους οποίους έχω μιλήσει για το θέμα είναι είτε ασκούμενοι Χριστιανοί είτε ασκούμενοι Εβραίοι. Αυτό λέει πολλά για το ποιον πραγματικά στοχεύει η συνωμοσία.
O Dr. Zelenko συνέχισε:
«Είμαι ρεαλιστής συνωμοσιολόγος. Ξέρετε, υπάρχει ένα έγκλημα για το οποίο οι άνθρωποι μπαίνουν στη φυλακή. Λέγεται συνωμοσία για τη διάπραξη φόνου. Η λέξη συνωμοσία σημαίνει ότι μια ομάδα ανθρώπων συγκεντρώθηκε για να σχεδιάσει κάτι πολύ, πολύ κακό. Οπότε, ναι, υπάρχει συνωμοσία. Απλά δεν είναι θεωρία. Είναι η πραγματικότητα. Και θα σας το δείξω αυτό. Έτσι, είναι ένα δύσκολο παζλ για να το συναρμολογήσετε, αλλά νομίζω ότι αν οι άνθρωποι το σκεφτούν και το διαλογιστούν, θα δείτε.
«Έχω αποδείξει ότι το COVID-19 είναι ένα βιολογικό όπλο και εκεί θα διαθέσω τα έγγραφα και τις πατέντες και το έγγραφο, πώς αυτό έχει γίνει και ποιος το πλήρωσε. Παρεμπιπτόντως, δεν είμαι ηλίθιος. Ξέρω ότι κάθε λέξη που λέω θα ελέγχεται υπερβολικά. Οι άνθρωποι ψάχνουν τρόπο να καταστρέψουν τη φήμη μου επειδή μιλάω ενάντια στην αφήγηση των κοινωνιοπαθών. Και γι’ αυτό προσέχω πολύ όταν λέω κάτι, ακόμη και αν είναι αμφιλεγόμενο ή ακούγεται απίστευτο, αλλά προσέχω πολύ να έχω τα στοιχεία που τεκμηριώνουν, τουλάχιστον το γιατί λέω αυτό που λέω. Αυτό είναι σημαντικό.
«Έτσι, αν κοιτάξετε δύο πατέντες, μου άνοιξαν πολύ τα μάτια. Το 2021, στις 31 Αυγούστου, εγκρίνεται ένα δίπλωμα ευρεσιτεχνίας – δίπλωμα ευρεσιτεχνίας των Ηνωμένων Πολιτειών – το οποίο έχει έκταση 50 σελίδων και είναι πολύ υψηλής τεχνολογίας, πολύπλοκη νανοτεχνολογία που περιγράφει αυτό που υπάρχει ήδη στα εμβόλια και περιγράφει αυτή την υψηλής τεχνολογίας ικανότητα μέτρησης βιομετρικών δεδομένων. Έτσι, δηλαδή, τον καρδιακό σας ρυθμό, τον αναπνευστικό σας ρυθμό, τη θερμοκρασία σας, και το πιο σημαντικό, μεταδίδει αυτά τα δεδομένα μαζί με την τοποθεσία σας σε ένα τρίτο μέρος.
«Τώρα, ξέρετε, το 2016, ο Κλάους Σβαμπ έδωσε μια συνέντευξη και είπε ότι μέσα σε 10 χρόνια, μέχρι το 2026, κάθε άνθρωπος θα έχει ένα ψηφιακό αναγνωριστικό. Οπότε πώς θα καταφέρετε -για ποιο λόγο θα μιλήσουμε σε ένα λεπτό- αλλά πώς θα καταφέρετε να πείσετε 7 δισεκατομμύρια ανθρώπους να συμφωνήσουν να τους χορηγηθεί ένα ψηφιακό αναγνωριστικό; Λοιπόν, τι θα λέγατε να δημιουργήσετε ένα όπλο, να το απελευθερώσετε και να τους τρομάξετε όλους. Απομονώνεις τους ανθρώπους, τους βάζεις μια πάνα προσώπου. Μετά βγάζεις μια λύση που δεν είναι στην πραγματικότητα λύση, αλλά είναι ένα ψέμα, και οι άνθρωποι έλκονται και τη ζητούν. Είναι πανέξυπνο.
«Εντάξει, υπάρχει και άλλη πατέντα. Αυτή την ξέρω απ’ έξω. Είναι πατέντα της Microsoft, 2020. Είναι μια εθνική πατέντα. Είναι WO-2020-060606. Και μιλάει για τη σύνδεση της μετάδοσης βιομετρικών δεδομένων με κρυπτογραφικές κάρτες. Υπάρχουν άλλα δύο, τρία πράγματα, μερικές λεπτομέρειες. Αν κοιτάξετε την ατζέντα του Παγκόσμιου Οικονομικού Φόρουμ για το 2030, το νούμερο ένα είναι ότι η Αμερική δεν θα είναι πλέον κυρίαρχη και λίγες δυνάμεις θα κυβερνούν τον κόσμο. Αυτή είναι η δηλωμένη ατζέντα, η οποία είναι τώρα η ατζέντα 2030 του ΟΗΕ.
«Αν κοιτάξετε τα στοιχεία από το Γραφείο Προϋπολογισμού του Κογκρέσου – και πάλι, τα έχω όλα αυτά – το Medicare θα καταστεί αφερέγγυο το 2026. Λοιπόν, αυτή η πληροφορία είναι γνωστή εδώ και 30 χρόνια, ότι είχαμε περάσει το όριο χωρίς επιστροφή. Ότι το Medicare και η Κοινωνική Ασφάλιση είχαν πεθάνει. Το μόνο μεταβλητό ήταν το πότε, και αυτό μπορούσε να ελεγχθεί πολύ απλά. Αν θέλατε να επισπεύσετε την ημερομηνία, απλά αυξάνατε τα δικαιώματα. Έτσι, το οδηγείτε στην αφερεγγυότητα πολύ πιο γρήγορα. Οι προβλέψεις ή απλά η κοινή λογική, οι παγκόσμιες επιπτώσεις στο παγκόσμιο οικονομικό σύστημα θα είναι καταστροφικές.
«Ας επιστρέψουμε λοιπόν για λίγο στην Κίνα. Η Κίνα μόλις δημιούργησε την κεντρική της τράπεζα, το ψηφιακό γουάν. Στη συνέχεια απαγόρευσαν κάθε άλλο κρυπτονόμισμα. Στη συνέχεια, συνέδεσαν το σύστημα κοινωνικής πίστωσης με το κρυπτονόμισμα, πράγμα που σημαίνει ότι αν η κινεζική κυβέρνηση, η οποία ελέγχει την κεντρική τράπεζα, δεν της αρέσει αυτό που λέτε, μπορεί να σας περιορίσει, να σας περιορίσει ή να σας αρνηθεί εντελώς τη δυνατότητα να κάνετε συναλλαγές.
«Έτσι, τώρα δεν χρειάζεται να σου φυτέψω μια σφαίρα στο κεφάλι. Θα σας εμποδίσω απλώς να αγοράσετε ψωμί. Αυτό είναι το, εννοώ, δεν έχω αποδείξεις γι’ αυτό, αλλά είναι απλά λογικό ότι αυτές οι πληροφορίες ήταν γνωστές για την επικείμενη οικονομική κατάρρευση από τα μέσα της δεκαετίας του ’90. Τώρα, ποιος θα χάσει τα περισσότερα από μια παγκόσμια οικονομική κατάρρευση; Λοιπόν, είναι οι πλουσιότεροι άνθρωποι στον κόσμο και όσοι έχουν εξουσία.
«Θέλουν λοιπόν να διατηρήσουν τον πλούτο και την εξουσία τους. Υπάρχει λοιπόν μια πολύ δημιουργική λύση και χρειάστηκε τόσος χρόνος για πολλούς λόγους, πρώτον, η τεχνολογία δεν υπήρχε. Έπρεπε να ολοκληρώσουν τη χαρτογράφηση του ανθρώπινου γονιδιώματος, να δημιουργήσουν ηθικά την τεχνολογία CRISPR Cas9, η οποία επιτρέπει την επεξεργασία γονιδίων, για την οποία θα μιλήσουμε σε ένα λεπτό, προκειμένου να οριστικοποιήσουν πραγματικά το όραμά τους.»Έτσι, όταν συμβεί η οικονομική κατάρρευση, το μόνο σύστημα που θα μείνει όρθιο θα είναι ένα παγκόσμιο σύστημα κρυπτονομισμάτων που θα ελέγχεται από λίγες παγκόσμιες δυνάμεις. Και για να συμμετάσχετε σε αυτό το σύστημα κρυπτονομισμάτων, θα πρέπει να είστε πομπός βιομετρικών δεδομένων. Έτσι, ξεχάστε το Apple Pay. Το χέρι σας, ουσιαστικά, θα είναι το εργαλείο μέσω του οποίου θα μπορείτε να πραγματοποιείτε συναλλαγές.
«Ακούγεται ωραίο, αλλά εδώ είναι τα προβλήματα. Τι γίνεται αν δεν θέλω να εμβολιαστώ; Τότε δεν μπορώ να συμμετέχω σε παγκόσμιες συναλλαγές, σε οικονομικές συναλλαγές. Κι αν δεν αρέσει στην κυβέρνηση αυτό που λέω; Οπότε θα περιορίσουν την ικανότητά μου να κάνω συναλλαγές. Είναι ένας μηχανισμός ελέγχου. Είναι υποδούλωση. Είναι αυτό που η χριστιανική πίστη θα αποκαλούσε το χάραγμα του θηρίου. Αυτή είναι λοιπόν η μία διάσταση του θέματος. Είναι ο έλεγχος. Η δουλεία ήταν πάντα η πιο επικερδής βιομηχανία στην ιστορία της ανθρωπότητας, Υπάρχουν ενεργά μέτρα για την υποδούλωση της ανθρωπότητας υπό τον έλεγχο λίγων παγκόσμιων κοινωνιοπαθών.
«Με άλλα λόγια, έχουμε να κάνουμε με τον Χίτλερ και τον Στάλιν σε στεροειδή με όπλα μαζικής καταστροφής».
Το ερώτημα τώρα στρέφεται στο ποιος πιστεύει ο Δρ Ζελένκο ότι κρύβεται πίσω από όλα αυτά. Είναι ένα θέμα που έχουμε καλύψει εκτενώς τους τελευταίους μήνες. Δεν υπάρχει απόλυτη συναίνεση, αλλά αρκετοί από τους πιο αξιοσέβαστους ανθρώπους με τους οποίους έχω μιλήσει για το θέμα έχουν δείξει προς τους ίδιους ανθρώπους που ο Δρ Ζελένκο πιστεύει ότι βρίσκονται πίσω από όλα αυτά.
Και στο επίκεντρο αυτού είναι το Παγκόσμιο Οικονομικό Φόρουμ, το οποίο ιδρύθηκε το 1971 και ξεκίνησε ένα παγκόσμιο σχολείο ηγεσίας. Οι πρώτοι απόφοιτοι αυτής της σχολής είναι η Άνγκελα Μέρκελ που διοικούσε τη Γερμανία και ο Μπιλ Γκέιτς. Στη συνέχεια, ο Γάλλος πρωθυπουργός, ο Μακρόν, ο Τζάστιν Τριντό, ο Άρντερν από τη Νέα Ζηλανδία, ο Μόρισον από την Αυστραλία, όλοι αυτοί οι κοινωνιοπαθείς είναι απόφοιτοι αυτής της ιδεολογίας. Είναι πόρνες. Δεν υπηρετούν τα συμφέροντα της χώρας τους. Δεν εξυπηρετούν τα συμφέροντα των πολιτών τους. Υπηρετούν έναν παγκόσμιο αφέντη και έχουν ξεπουλήσει τις χώρες τους και η Αμερική δεν διαφέρει.
«Επιτρέψτε μου λοιπόν να φέρω και εγώ μερικά γεγονότα στο τραπέζι. Ο Klaus Schwab και ο Bill Gates έχουν πει και οι δύο ότι αυτά τα εμβόλια αλλάζουν το ποιος είσαι. Αυτή δεν είναι η δική μου φράση. Είναι δική τους. Και συνεχίζουν να εξηγούν μέσω της τεχνολογίας γονιδιακής επεξεργασίας ότι η πλατφόρμα mRNA έχει σχεδιαστεί για να εισαγάγει την τεχνολογία CRISPR Cas9, η οποία είναι ουσιαστικά ένα ψαλίδι που κόβει ένα τμήμα του γενετικού σας κώδικα και το τμήμα μπορεί να προσαρμοστεί. Μπορείτε να επιλέξετε πού θα κοπεί και στη συνέχεια μπορείτε να συνδέσετε ξένο κώδικα, ξένο DNA.
«Τώρα, είμαστε φτιαγμένοι κατ’ εικόνα του Θεού. Τι σημαίνει αυτό; Λοιπόν, σημαίνει ότι η σοφία Του αποτυπώνεται στον γενετικό μας κώδικα, επειδή ο γενετικός μας κώδικας καθορίζει ποιοι είμαστε. Ας ονομάσουμε λοιπόν τον άνθρωπο 1.0, την έκδοση του Θεού. Αυτό που ενδιαφέρονται να κάνουν οι κοινωνιοπαθείς – και θα μιλήσουμε για το γιατί σε ένα λεπτό – είναι να δημιουργήσουν τον άνθρωπο 2.0 ή αυτό που ονομάζουν υπερανθρωπισμό.
«Πιστεύουν ότι μέσω του ευφυούς σχεδιασμού – είναι ευφυής σχεδιασμός – μπορούν να δημιουργήσουν έναν καλύτερο άνθρωπο. Έτσι, όποιος έχει πέσει θύμα αυτών των εμβολίων είναι πλέον φτιαγμένος κατ’ εικόνα και ομοίωση του Bill Gates και του Klaus Schwab. Δεν θα έδινα σε αυτούς τους εκφυλισμένους τον κωδικό πρόσβασης στο ηλεκτρονικό μου ταχυδρομείο. Γιατί να τους δώσω πρόσβαση στον γενετικό μου κώδικα;
«Αυτοί είναι οι δηλωμένοι στόχοι τους, όχι οι δικοί μου. Και έτσι αυτοί είναι άθεοι άνθρωποι που δεν πιστεύουν σε μια μετά θάνατον ζωή. Όταν λοιπόν βλέπεις την ύπαρξη από αυτή την οπτική γωνία, δεν θέλεις να πεθάνεις. Και έτσι αυτό με το οποίο ασχολούνται ενεργά είναι η δημιουργία ανόργανων πλατφορμών ή cyborgs ή ρομπότ όπου πιστεύουν ότι μπορούν να μεταφέρουν τη συνείδησή τους και ουσιαστικά να επιτύχουν την αθανασία.»Και αυτή είναι η κατάσταση των στόχων τους. Κοιτάξτε τον Ray Carswell και τον Yuval Noah Harari, πραγματικοί κοινωνιοπαθείς. Ο Χαράρι είναι ο αγαπημένος συγγραφέας του Ομπάμα. Το είπε αυτό στο CNN. Και έτσι αυτό που θέλουν να κάνουν αυτοί οι εκφυλισμένοι είναι ότι έχουν χακάρει κυριολεκτικά τον κώδικα του ανθρώπινου γονιδιώματος και είναι σε θέση, ξέρετε, αν το ήθελαν, να σας κολλήσουν DNA αλόγου.
«Ξέρετε, το 2004, υπήρξε μια παρουσίαση της CIA. Την αποδίδουν στον Μπιλ Γκέιτς, αλλά αυτό δεν είναι αλήθεια, αλλά η παρουσίαση είναι αληθινή. Διέρρευσε ότι εντόπισαν ένα γονίδιο Τζιχάντι, ένα γονίδιο που σχετίζεται με τον θρησκευτικό εξτρεμισμό και εργαζόμαστε πάνω σε, τεχνολογία για την καταστολή αυτού του γονιδίου. Με άλλα λόγια, γενετική χειραγώγηση των χαρακτηριστικών.»Τώρα μπορεί να συμφωνήσουμε ή να μην συμφωνήσουμε με αυτό. Δεν είναι αυτό το θέμα. Το θέμα είναι ότι εμπαίζουν τον Θεό. Ας πούμε ότι για κάποιους λόγους θέλουν και δεν θέλουν να καταστείλουν τα μπλε μάτια. Μπορούν να το κάνουν αυτό. Τι γίνεται αν θέλουν να καταστείλουν τα μοτίβα της σκέψης σας; Ή να χειραγωγήσουν τα μοτίβα της σκέψης σας; Όλη αυτή η τεχνολογία αναπτύσσεται.
«Και έτσι υπάρχει μια υπεράνθρωπη τελική ατζέντα εδώ. Υπάρχει επίσης μια ατζέντα ελέγχου του πληθυσμού. Υπάρχει κάτι που ονομάζεται Georgia Guidestones. Κανείς δεν ξέρει ποιος το έκανε πραγματικά, αλλά η πρώτη δήλωση είναι – την αποκαλούν οι 10 εντολές – ότι ο παγκόσμιος πληθυσμός πρέπει να μειωθεί στα 500 εκατομμύρια. Ο Μπιλ Γκέιτς το 2015 σε μια διάλεξη στο Ted είπε ότι η υπερθέρμανση του πλανήτη είναι η μεγαλύτερη απειλή για τον πλανήτη και επομένως πρέπει να περιορίσουμε τις εκπομπές διοξειδίου του άνθρακα. Και ο τρόπος για να γίνει αυτό είναι να μειωθεί ο παγκόσμιος πληθυσμός κατά 10-15% με τη χρήση εμβολίων. Έτσι το 2020, ο ίδιος κοινωνιοπαθής είπε ότι πρέπει να εμβολιαστούν 7 δισεκατομμύρια άνθρωποι. Οπότε εδώ είναι μια απλή ερώτηση. Γιατί να πάρω ένα εμβόλιο για την υγεία μου από κάποιον που υποστηρίζει και χρηματοδοτεί μια τεχνολογία για τη μείωση του παγκόσμιου πληθυσμού;
«Και, και ας δούμε τι κάνουν αυτά τα εμβόλια. Δημοσιεύθηκε λοιπόν ένα άρθρο σε μια ισραηλινή εφημερίδα, σύμφωνα με το οποίο τα ισραηλινά γραφεία κηδειών έχουν δει δεκαπλάσια αύξηση των θανάτων, των νεκρών ανθρώπων- έχουν κατακλυστεί εντελώς και δεν έχουν τη δυνατότητα να δώσουν σε όλους μια σωστή κηδεία. Και σύμφωνα με την κυβέρνηση, οι άνθρωποι πεθαίνουν από την Omicron.»Τώρα, υπάρχει ένα πρόβλημα με αυτή την ανάλυση, επειδή κανείς άλλος δεν πεθαίνει από το Omicron. Στη Νότια Αφρική, όπου ξεκίνησε, κανείς δεν πέθανε από το Omicron. Στην Αμερική με αποτελεσματική θεραπεία, κανείς δεν πεθαίνει από το Omicron. Κατά την άμεση εμπειρία μου, κανείς δεν πεθαίνει από το Omicron και υπάρχει λόγος που συμβαίνει αυτό. Είναι αλήθεια ότι είναι πολύ πιο μολυσματικό ακόμη και από την ιλαρά, ωστόσο, έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζει μόνο τους ανώτερους αεραγωγούς και όχι τους κατώτερους αεραγωγούς. Έτσι, γλιτώνει το καταστροφικό σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας. Έτσι, οι άνθρωποι δεν αναπτύσσουν τέτοιου είδους επιπλοκές. Και έτσι, γιατί πεθαίνουν οι Ισραηλινοί; Και οι νεότεροι επίσης; Λοιπόν, το Ισραήλ αποδεικνύεται ότι είναι η πιο εμβολιασμένη χώρα στον κόσμο από την άποψη των πολλαπλών ενέσεων. Για παράδειγμα, ηγείται παγκοσμίως στον αριθμό των πολιτών του που έχουν κάνει τέσσερα εμβόλια.
«Τώρα, τι θα λέγατε αν σας έλεγα ότι υπάρχουν 30 επιστημονικές εργασίες που γνωρίζω, οι οποίες έχουν τεκμηριώσει πώς αυτά τα εμβόλια καταστρέφουν το έμφυτο ανοσοποιητικό σας σύστημα; Καταστρέφουν τη λειτουργία των Τ-κυττάρων σας. Καταστρέφουν τη λειτουργία των φυσικών κυττάρων δολοφόνων. Και καταστέλλουν τα γονίδια καταστολής όγκων.
«Έτσι, αν κάποιος έχει ανοσοανεπάρκεια, τότε ναι, μπορεί να πεθάνει από ένα κρυολόγημα και μπορεί να πεθάνει από το Omicron. Πώς λοιπόν απέκτησαν αυτή την ανοσοανεπάρκεια; Λοιπόν, την απέκτησαν. Λοιπόν, πώς την απέκτησαν; Λοιπόν, δεν είναι μέσω του ιού HIV, οπότε δεν ξέρω. Θα μπορούσε να είναι το εμβόλιο; Και πώς θα το ονομάζατε αυτό τότε;
«Ένα σύνδρομο επίκτητης ανοσολογικής ανεπάρκειας.»Και, ξέρετε, το Ὑπουργείου Εσωτερικής Ασφάλειας εξέδωσε διάταγμα πριν από δύο ημέρες ότι η ομιλία ενάντια στις κυβερνητικές αφηγήσεις για τα εμβόλια θεωρείται πλέον εγχώρια τρομοκρατία. Αυτό σημαίνει ότι έχουν πλέον την, υποθέτω την άδεια, ή δεν θα έλεγα την εξουσία, αλλά το θράσος ότι θα αρχίσουν να φυλακίζουν χωρίς τη δέουσα διαδικασία.
«Άνθρωποι όπως εγώ ή άλλοι, όπως ο Δρ Μαλόουν, ο Δρ ΜακΚάλοου, ο Δρ Γκολντ, επιτίθενται στους παλαιότερους από τους αγωνιστές της ελευθερίας. Και μπορούν τεχνικά να μας βάλουν στο Γκουαντάναμο. Και έτσι αυτό που παρακολουθούμε είναι η καταπάτηση των συνταγματικών μας δικαιωμάτων, η καταπάτηση της ελευθερίας του λόγου και πραγματικά μια προσπάθεια να καταστραφεί η ψυχή αυτής της χώρας. Και να ενώσουμε όλη την κυβέρνηση υπό την ηγεσία μιας παγκοσμιοποιημένης ηγεσίας».
Υπάρχουν τόσα πολλά άλλα που ο Δρ Ζελένκο κάλυψε στη συνέντευξη. Θα ήθελα πολύ να δημοσιεύσω ένα πλήρες κείμενο, αλλά είναι τόσα πολλά που θα μπορούσαν να γίνουν ένα μικρό βιβλίο. Ο καλύτερος τρόπος για να τα αφομοιώσετε όλα αυτά είναι να ακούσετε το podcast ή να παρακολουθήσετε το βίντεο. Δεν την επεξεργάστηκα, οπότε υπάρχουν στιγμές που ο Δρ Ζελένκο δυσκολεύτηκε, στιγμές που παραλίγο να κόψω τη συνέντευξη. Συνεχίζει να δίνει τον καλό αγώνα παρά το γεγονός ότι έχει έναν πνεύμονα και καρκίνο. Αυτού του είδους η αποφασιστικότητα είναι αυτό που απαιτείται από περισσότερους ανθρώπους, αν θέλουμε να νικήσουμε τις παγκοσμιοποιητικές, υπεράνθρωπες δυνάμεις που είναι αποφασισμένες να μας υποτάξουν ή να μας εξοντώσουν.
Όπως σημείωσε ο Δρ Ζελένκο κοντά στο τέλος, αυτό θα απαιτήσει κάτι περισσότερο από την ανθρώπινη παρέμβαση. Χρειαζόμαστε υπερφυσική υποστήριξη, γεγονός που καθιστά την προσευχή και τη νηστεία τόσο σημαντικές. Μόνο ο Θεός μπορεί πραγματικά να μας σώσει από αυτό, αν είναι το θέλημά Του. Και αν επιλέξει να μην επέμβει, τότε μάλλον βρισκόμαστε στους έσχατους καιρούς. Όπως και να έχει, είναι καιρός για μεγάλη χαρά, καθώς σημαίνει είτε μια μαζική αναγέννηση είτε ότι η επιστροφή του Κυρίου και Σωτήρα μας είναι πιθανότατα κοντά. Κερδίζουμε σε κάθε περίπτωση.
O Γιώργος Ευαγγελάτος ψυχίατρος – ψυχαναλυτής παρέχει ψυχιατρική βοήθεια και συμβουλευτική σε ανθρώπους που αντιμετωπίζουν προσωπικές ή οικογενειακές ψυχολογικές και ψυχοκοινωνικές δυσκολίες. Μάθετε περισσότερα για εμάς εδώ.
Μια ΕΞΑΙΡΕΤΙΚΗ συνέντευξη στον
Πρόσφατα Σχόλια